黃榮寧，縱 帥，賈 偉，趙志軍，潘月英，徐廣賢，魏 軍

2.寧夏醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，銀川 750004；

3.寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，銀川 750004

SCCmecIII型MRSA誘導(dǎo)SD大鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡的研究＊

黃榮寧1，縱 帥2，賈 偉3，趙志軍3，潘月英3，徐廣賢2，魏 軍3

目的 研究SCCmecIII型耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）誘導(dǎo)SD大鼠肺泡巨噬細(xì)胞（AM）凋亡的能力。方法 熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀分別用于觀察和檢測(cè)MRSA感染AM 2h、6h和12h后Annexin V－FITC/PI染色的凋亡細(xì)胞形態(tài)和凋亡率，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT－PCR）檢測(cè)凋亡相關(guān)基因。結(jié)果 AM在MRSA感染后6h和12h時(shí)凋亡率與對(duì)照組相比差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；感染12h時(shí)凋亡相關(guān)基因Apaf－1、caspase－9和Bax表達(dá)顯著上調(diào)，Bcl－2mRNA表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）。結(jié)論 MRSA可通過(guò)線粒體通路經(jīng)多基因參與誘導(dǎo)AM凋亡；AM凋亡的研究可為MRSA肺部感染時(shí)AM凋亡分子機(jī)制的進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；肺泡巨噬細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

2.寧夏醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，銀川 750004；

3.寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，銀川 750004

肺泡巨噬細(xì)胞（alveolar macrophage，AM）是一種高度分化、成熟的單核吞噬細(xì)胞，由血液中單核細(xì)胞遷入肺組織后分化而成，是肺部感染時(shí)免疫調(diào)節(jié)的核心細(xì)胞。國(guó)內(nèi)外研究表明，不僅某些革蘭陰性菌可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的凋亡，金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，SAU）也能夠誘導(dǎo)包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的多種免疫細(xì)胞凋亡［1－3］。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 （methicillin－resistantStaphylococcusaureus，MRSA）作為一種含有耐藥基因的特殊SAU，其誘導(dǎo)AM凋亡的能力和途徑尚未見詳細(xì)報(bào)道。本研究通過(guò)建立SD大鼠AM體外培養(yǎng)和感染模型，研究SCCmecIII型MRSA誘導(dǎo)AM凋亡的能力，旨在初步探討MRSA肺部感染時(shí)AM凋亡及其分子機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年SD雌性大鼠由寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，飼養(yǎng)至體質(zhì)量為（275±25）g后用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑和儀器 MH 瓊脂培養(yǎng)基，DPBS，細(xì)胞培養(yǎng)液（含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液），Annexin V－FITC/PI凋亡試劑盒，TRIzol，大連寶生物Prime Script RT reagent和SYBR Premix Ex TaqTM II試劑盒；實(shí)驗(yàn)凋亡相關(guān)基因引物由上海生工生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成；高速低溫離心機(jī)，日本OLYMPUS BX51/DP72熒光顯微鏡，美國(guó)Guava流式細(xì)胞儀，ABI PRISM7300Real－Time PCR儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株及菌液制備 本實(shí)驗(yàn)所用MRSA菌株分離自寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院燒傷科一院內(nèi)感染患者，其分離、培養(yǎng)和鑒定依照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第3版）和美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2010標(biāo)準(zhǔn)［4］執(zhí)行。經(jīng)DNA 提取，特異片段PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳［5］，鑒定為SCCmecIII型MRSA。SAU標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25923作為本實(shí)驗(yàn)的質(zhì)控菌株，同時(shí)作為甲氧西林敏感性金黃色葡萄 球 菌 （methicillin－sensitiveStaphylococcusaureus，MSSA）用于實(shí)驗(yàn)。MRSA與MSSA一起經(jīng)藥敏試驗(yàn)后用于實(shí)驗(yàn)。上述實(shí)驗(yàn)菌株接種于MH平板，37℃培養(yǎng)16～18h后，挑選單個(gè)生長(zhǎng)菌落用生理鹽水洗滌3次后細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，麥?zhǔn)媳葷醿x調(diào)節(jié)菌懸液終濃度為3個(gè) MCF單位（9×108cfu/mL），4℃冷藏備用。

1.2.2 AM的獲取和純化 使用3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉SD大鼠，經(jīng)75%的乙醇浸泡口腔以下部位消毒后分離氣管，10mL注射器吸取4℃DPBS經(jīng)輸液管沖洗肺泡并回抽肺泡灌洗液，重復(fù)數(shù)次，直至收集50mL灌洗液，4℃1000g離心10min，棄上清，加入細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，得到的即為AM。將上述細(xì)胞懸液置于6孔板5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)4h，DPBS洗滌除去非貼壁細(xì)胞，得到純化的AM。重懸至106個(gè)/mL繼續(xù)培養(yǎng)4h貼壁，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 凋亡細(xì)胞的形態(tài)觀察和凋亡率檢測(cè) 將純化后在6孔板中貼壁培養(yǎng)4h的AM培養(yǎng)液棄去并加入新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，設(shè)置2h、6h和12h3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分對(duì)照組、MRSA組和MSSA組進(jìn)行試驗(yàn)，第1組為空白對(duì)照，第2和第3組分別加入上述MRSA和MSSA菌液100μL，于5%CO2、37℃培養(yǎng)后分別收集上述時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞，按Annexin V－FITC/PI試劑盒說(shuō)明進(jìn)行染色后熒光顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)。完全相同的方法處理后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)上述時(shí)間點(diǎn)的AM凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 qRT－PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因 凋亡基因及內(nèi)參基因β－action引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，序列見表1。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備參照文獻(xiàn)［6］，并依次稀釋為5個(gè)梯度備用。采用TRIzol一步法抽提三組AM總RNA，鑒定合格后按試劑盒說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄出cDNA，進(jìn)而以梯度濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品及cDNA為模板，按SYBR Premix Ex TaqTM II試劑盒說(shuō)明配制反應(yīng)體系，ABI PRISM 7300Real－Time PCR System兩步法進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因引物Table 1 Primers of genes associated with apoptosis

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料均以±s表示，經(jīng)Levene檢驗(yàn)證實(shí)方差齊（P＞0.05）后行采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD－t檢驗(yàn)，組內(nèi)兩兩比較采用SNK－q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 凋亡細(xì)胞在熒光顯微鏡下的形態(tài) 根據(jù)Annexin V－FITC/PI染色原理和說(shuō)明操作，熒光顯微鏡下可見凋亡細(xì)胞，對(duì)照組凋亡的AM較少，MSSA和MRSA感染組均可見數(shù)量不等的凋亡細(xì)胞，其數(shù)量隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。感染12h的凋亡細(xì)胞染色形態(tài)見圖1。根據(jù)染色原理，圖中綠色細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核呈橙/紅色的細(xì)胞為死亡細(xì)胞。

2.2 不同時(shí)間點(diǎn)AM凋亡率的檢測(cè) Annexin VFITC/PI染色后，在488nm激發(fā)波長(zhǎng)下經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，結(jié)果見圖2，圖中右下象限（LR區(qū)）內(nèi)Annexin V－FITC＋/PI－細(xì)胞代表早期凋亡細(xì)胞。對(duì)照組AM僅2h與12h間凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩感染組凋亡率均隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，各時(shí)間點(diǎn)間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝114.943，P＜0.01；F＝56.878，P＜0.01）；三組間在2h的凋亡率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝1.476，P＝0.301），但兩個(gè)感染組與對(duì)照組在6h和12h凋亡率差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝41.946，P＜0.01；F＝105.553，P＜0.01）；MRSA感染組與MSSA感染組在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的凋亡率差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組不同時(shí)間點(diǎn)凋亡率見表2。

表2 AM在三組不同時(shí)間點(diǎn)的凋亡率（%，±s）Table 2 The apoptosis rate of AM in different groups and times（%，±s）

表2 AM在三組不同時(shí)間點(diǎn)的凋亡率（%，±s）Table 2 The apoptosis rate of AM in different groups and times（%，±s）

LSD－t test or SNK－qtest：compared with control group at the same time，＊P＜0.01.In the same group，compared with 2h，＃P＜0.01，compared with 6h，△P＜0.05

分 組2h 6h 12h對(duì)照組 2.48±0.54 3.28±0.36 3.65±0.62＃MRSA感染組 3.20±0.47 8.90±0.33＊＃10.99±0.97＊?！鱉SSA感染組 3.41±0.96 7.44±1.26＊＃12.05±0.68＊?！?/p>

2.3 凋亡相關(guān)基因的的qRT－PCR結(jié)果 根據(jù)上述凋亡率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和趨勢(shì)分析，本實(shí)驗(yàn)選取12h點(diǎn)進(jìn)行 Apaf－1、caspase－9、Bax和 Bcl－2等四種凋亡相關(guān)基因的qRT－PCR檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，感染12h后，Apaf－1、caspase－9和 Bax的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），Bcl－2的 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）。qRT－PCR相對(duì)定量結(jié)果見圖3。

圖3 四種凋亡相關(guān)基因的qRT－PCR相對(duì)定量結(jié)果Fig.3 The qRT－PCR relative quantitative results of four genes associated with apoptosis

3 討 論

MRSA是目前最主要的醫(yī)院內(nèi)感染革蘭陽(yáng)性菌，我國(guó)大陸地區(qū)院內(nèi)感染分離株以SCCmecIII型為主［7］，因此，本實(shí)驗(yàn)選取院內(nèi)感染患者分離的SCCmecIII型MRSA株來(lái)研究SD大鼠肺部感染時(shí)AM的凋亡具有代表性。在MRSA所致的嚴(yán)重臨床感染中最重要的就是菌血癥和院內(nèi)獲得性肺炎（HAP），同時(shí)MRSA也是引起世界范圍內(nèi)HAP高發(fā)病率和高死亡率的重要病原菌［8］。AM作為肺部免疫應(yīng)答的核心細(xì)胞，在由微生物感染引起的肺部炎癥和損傷時(shí)最早被激活并參與一系列的免疫反應(yīng)，其中，介導(dǎo)和調(diào)控AM凋亡便是其維持肺部正常免疫穩(wěn)定狀態(tài)的重要方式之一。

在正常細(xì)胞，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的PS由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)，同時(shí)保持細(xì)胞膜的完整性；Ca2＋依賴性磷脂結(jié)合蛋白Annexin V可與PS高親和力特異性結(jié)合，核酸染料Propidium iodide（PI）可與細(xì)胞核結(jié)合，但不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜。基于以上原理，本實(shí)驗(yàn)采用Annexin V－FITC/PI雙染法，可看到圖1所示的凋亡細(xì)胞。在本實(shí)驗(yàn)三個(gè)既定的時(shí)間點(diǎn)，體外培養(yǎng)的AM自發(fā)凋亡率低，且隨時(shí)間延長(zhǎng)增加緩慢。MRSA和MSSA感染后2h時(shí)，由于細(xì)菌此時(shí)處于遲緩增長(zhǎng)期，數(shù)量較少，誘導(dǎo)AM產(chǎn)生凋亡的數(shù)量亦較少；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)菌進(jìn)入快速的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，細(xì)菌大量繁殖，數(shù)量增長(zhǎng)迅速，被吞噬進(jìn)入AM內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量顯著增加，繼而引起細(xì)胞內(nèi)一系列反應(yīng)，并通過(guò)一定的途徑誘導(dǎo)AM凋亡，細(xì)胞的凋亡率不斷增加（見表2），相關(guān)研究結(jié)果與劉勇等報(bào)道相似［3］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示MRSA具有誘導(dǎo)AM凋亡的能力，但結(jié)果同時(shí)表明，MRSA和MSSA誘導(dǎo)AM凋亡的能力差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與它們對(duì)細(xì)胞的侵襲過(guò)程和侵襲力均相似有關(guān)［9］。

AM凋亡的確切機(jī)制和具體通路至今尚未闡明，經(jīng)典的細(xì)胞凋亡通路有線粒體通路和細(xì)胞膜死亡受體通路兩種。作為細(xì)胞凋亡調(diào)控中心的線粒體在受到不同形式的細(xì)胞刺激信號(hào)刺激時(shí)釋放細(xì)胞色素C至胞漿，在dATP/ATP存在的條件下與Apaf－1結(jié)合成多聚體，促使caspase－9與其結(jié)合形成凋亡小體，被激活的caspase－9能激活其下游的caspase－3等，繼而通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Bcl－2基因家族作為重要的凋亡調(diào)控因子在上述線粒體通路中扮演重要角色，Bax和Bcl－2表達(dá)的比例決定了細(xì)胞的生存或凋亡。Bcl－2可以和Bax結(jié)合抑制細(xì)胞凋亡，當(dāng)Bax表達(dá)水平增加時(shí)可拮抗bcl－2的作用并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［10］。本試驗(yàn)結(jié)果提示，在MRSA感染AM后，可通過(guò)線粒體通路的相關(guān)凋亡基因 Apaf－1、caspase－9和 Bax表達(dá)的上調(diào)及 Bcl－2的下調(diào)誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。但MRSA誘導(dǎo)的AM凋亡是否存在細(xì)胞膜死亡受體等其他通路及其機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究，本實(shí)驗(yàn)亦為MRSA肺部感染時(shí)AM凋亡分子機(jī)制的進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)。

［1］Baran J，Weglarczyk K，Mysiak M，et al.Fas（CD95）－Fas ligand interactions are responsible for monocyte apoptosis occurring as a result of phagocytosis and killing ofStaphylococcusaureus［J］.Infect Immun，2001，69（3）：1287－1297.

［2］Weglarczyk K，Baran J，Zembala M，et al.Caspase－8activation precedes alterations of mitochondrial membrane potential during monocyte apoptosis induced by phagocytosis and killing ofStaphylococcusaureus［J］.Infect Immun，2004，72（5）：2590－2597.

［3］劉勇，徐飛，管俊昌，等.金黃色葡萄球菌及其L型誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞凋亡研究［J］.中國(guó)人獸共患病雜志，2005，21（8）：735.

［4］Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing；Twentieth informa－tional supplement［S］.CLSI documents M100－S20.CLSI，2010：60－75.

［5］Chongtrakool P，Ito T，Ma XX，et al.Staphylococcal cassette chromosome mec （SCCmec）typing of methicillin－resistantStaphylococcusaureusstrains isolated in 11Asian countries：a proposal for a new nomenclature for SCCmec elements［J］.Antimicrob Agents Chemother，2006，50（3）：1001－1012.

［6］羅勇軍，劉昕.實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品的制備及應(yīng)用［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2005，34（3）：414－415.

［7］Yan X，Tao X，He L，et al.Increasing Resistance in Multiresistant Methicillin－ResistantStaphylococcusaureusClones Isolated from a Chinese Hospital Over a 5－Year Period［J］.Microb Drug Resist，2011，17（2）：235－239.

［8］Aston JL，Dortch MJ，Dossett LA，et al.Risk factors for treatment failure in patients receiving vancomycin for hospital－acquired methicillin－resistantStaphylococcusaureuspneumonia［J］.Surg Infect（Larchmt），2010，11（1）：21－28.

［9］劉挺，管遠(yuǎn)志.耐甲氧青霉素金黃色葡萄球菌與敏感菌株侵襲宿主細(xì)胞過(guò)程之比較［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2003，23（5）：525－530.

［10］Brooks C，Dong Z.Regulation of mitochondrial morphological dynamics during apoptosis by Bcl－2family proteins：a key in Bak？［J］.Cell Cycle，2007，6（24）：3043－3047.

Apoptosis of SD rat alveolar macrophage induced by SCCmec type III MRSA

HUANG Rong－ning，ZONG Shuai，JIA Wei，ZHAO Zhi－jun，PAN Yue－ying，XU Guang－xian，WEI Jun

（SixthAffiliatedHospital，GuangxiMedicalUniversity，Yulin537000，China）

To study the apoptosis of SD rat alveolar macrophage（AM）induced by SCCmec type III methicillin－resistantStaphylococcusaureus（MRSA），the apoptosis of AM stained by Annexin V－FITC/PI at different times after infection with MRSA was determined by fluorescence microscope and flow cytometry.The genes associated with apoptosis were also detected by real－time quantitative polymerase chain reaction（qRT－PCR）.Results displayed that compared with the control group，the rates for apoptosis of AM at 6hour and 12hour after infection showed statistical significance（P＜0.01）；the gene expression of Apaf－1，caspase－9and Bax were significantly up－regulated，whereas Bcl－2was significantly down－regulated（P＜0.05）.It＇s supposed that MRSA could induce apoptosis of AM by mitochondrial pathway，which might be the result of up－regulation and down－regulation of genes associated with apoptosis；it might provide a basis for the molecular mechanism of AM in pulmonary infections by MRSA.

methicillin－resistantStaphylococcusaureus；alveolar macrophage；apoptosis

R378.1

A

1002－2694（2011）10－0877－05

＊2010年度寧夏回族自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目（黃榮寧和縱帥同等貢獻(xiàn)）

魏軍，Email：lydiajunwei＠hotmail.com

1.廣西醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院玉林市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，玉林 537000；

2011－05－23；

2011－07－11