李 斌 ，蘇乾蓮 ，趙 武 ，秦毅斌 ，梁家幸 ，何 穎 ，梁保忠 ，嚴(yán)子斌 ，覃 勇 ，韋建華 ，段群棚 ，許力匆

（ 1. 廣西獸醫(yī)研究所，廣西南寧 530001；2. 橫縣動物疫病預(yù)防控制中心，廣西橫縣 530300；3. 百色市動物疫病預(yù)防控制中心，廣西百色 533000；4. 河池市動物疫病預(yù)防控制中心，廣西河池 547000 ）

養(yǎng)牛業(yè)是廣西的優(yōu)勢和特色產(chǎn)業(yè)，但至今尚未見廣西牛HEV感染檢測的相關(guān)報道。本研究應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄—套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-nPCR），對采自廣西8個市牛糞、肝樣品進(jìn)行HEV檢測，為廣西牛群HE的流行病學(xué)研究及監(jiān)測防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 牛糞、牛肝樣品

采自廣西8個市的奶牛場、屠宰場、菜市場的新鮮牛糞樣品183份、新鮮牛肝樣品25份。

1.2 HEV RNA檢測的陽性、陰性對照

陽性對照：經(jīng)RT-PCR檢測和核苷酸序列測定為HEV陽性的豬糞病料；陰性對照：本實(shí)驗(yàn)室采集的，經(jīng)RT-PCR檢測為豬流行性腹瀉病毒（PEDV）陽性的豬糞病料。

1.3 RNA抽提及RT-PCR試劑

Trizol Reagent購 自Invitrogen公 司，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司，RNA酶抑制劑購自寶生物工程（大連）有限公司，Taq酶購自Fermentas公司，dNTPs購自生工生物工程（上海）有限公司，DNA Marker購自廣州東盛生物科技有限公司，DEPC H2O自己制備。

1.4 引物合成

根據(jù)基因Ⅰ-Ⅳ型HEV的ORF2基因序列，合成兩對簡并引物進(jìn)行RT-nPCR[1]，這兩對引物可擴(kuò)增四種基因型HEV的ORF2保守區(qū)內(nèi)基因序列，其內(nèi)套PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為436 bp。引物序列如下，外套引物HEV-A：5'-TAYCGHAAYCAAGGHTGGCG-3'，HEV-B ：5'-TG YTGGTTRTCRTARTCCTG-3'；內(nèi)套引物HEV-C：5'-AC YTCHGGBGTBGCKGAGGA-3'，HEV-D：5'-GCTCGCC ATTGGCTGAGAC-3'，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.5 RNA模板的提取

用Trizol Reagent對處理好的牛糞、牛肝樣品及HEV陽陰性對照病料進(jìn)行總RNA的提取。

1.6 反轉(zhuǎn)錄

RT反應(yīng)采用25 μL反應(yīng)體系，其組成如下：5×RT Buffer 5 μL，dNTPs（10 mmol/L）2 μL，引 物 HEV-B（25 μmol/L）1μL，RNA 酶 抑 制 劑（40U/ μL）0.5 μL，M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（200U/ μL）0.5 μL，RNA 模板 16 μL。RT反應(yīng)條件：42 ℃ 60 min，最后終止于4 ℃。

1.7 套式PCR擴(kuò)增

套式PCR反應(yīng)采用25 μL反應(yīng)體系，外套PCR組成 如 下 ：DEPC H2O 17.6 μL，10×Dream Taq Buffer（includes 20 mmol/L MgCl2） 2.5 μL，dNTPs（10 mmol/L）0.5 μL，外 套 PCR 引 物 HEV-A、HEV-B（25 μmol/L）各 0.5 μL，Dream Taq 酶（5U/ μL）0.4 μL，cDNA 模 板3 μL ；內(nèi)套 PCR 組成如下 ：DEPC H2O 17.6 μL，10×Dream Taq Buffer （includes 20 mmol/L MgCl2）2.5 μL，dNTPs（10 mmol/L）0.5 μL，內(nèi) 套 PCR 引物 HEV-C、HEV-D（25 μmol/L）各 0.5 μL，Dream Taq 酶（5U/ μL）0.4 μL，外套 PCR 產(chǎn)物模板 3 μL。外、內(nèi)套PCR均為相同的反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，進(jìn)入循環(huán)95 ℃ 50 s→53 ℃ 50 s→ 72 ℃ 1 min，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，終止于4 ℃。

1.8 PCR產(chǎn)物的檢測

取 20 μL 內(nèi) 套 PCR 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物，加 入 4 μL6×Loadding Buffer，于混有EB替代物的1%瓊脂糖凝膠中以120 V 100 mA電泳40 min，于紫外燈下觀察電泳結(jié)果，并于凝膠成像系統(tǒng)拍照保存結(jié)果。

1.9 檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0對廣西8個市樣品牛HEV檢測陽性率結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行單樣本非參數(shù)檢驗(yàn)（卡方檢驗(yàn)），對分別檢測廣西牛糞、牛肝樣品HEV檢測陽性率結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)（Mann-Whitney U 檢驗(yàn)）[2]。

2 結(jié)果

2.1 RT-nPCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

檢測HEV為陽性的牛糞、牛肝樣品和HEV陽性對照病料的內(nèi)套PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后都可見436bp特異性目的條帶，而陰性對照病料的內(nèi)套PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后則無此條帶（圖1）。

2.2 RT-nPCR檢測廣西8個市樣品牛HEV結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析

在所檢廣西8個市樣品中，HEV陽性率最高的是梧州市（72.73%），陽性率最低的是百色市（0%）。其余6個市樣品的檢出HEV平均陽性率為15%（24/160）（表1）。用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0對廣西8個市樣品牛HEV檢測陽性率結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行卡方檢驗(yàn)（Chi-Square Test），結(jié)果卡方值 χ2=122.414，相伴概率（Asymp.Sig.）P=0.000，小于顯著性水平0.05，所以廣西8個市樣品牛HEV檢測陽性率存在顯著性差異。這可能與各地樣品的檢測數(shù)量及樣品是否采自牛HEV排毒期等因素相關(guān)。

2.3 RT-nPCR分別檢測廣西牛糞、牛肝樣品HEV結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用RT-nPCR所檢測的廣西6個市牛糞HEV的陽性率最高為87.5%（14/16），最低為0%（0/20），平均陽性率為19.13%（35/183）；所檢測的廣西4個市牛肝HEV的陽性率最高為33.33%（2/6），最低為0%（0/6），平均陽性率為 20%（5/25）（表 2）。用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0對牛糞、牛肝樣品HEV檢測陽性率結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行兩獨(dú)立樣本的Mann-Whitney U檢驗(yàn)，結(jié)果該法的Z檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量Z=-0.430，雙側(cè)檢驗(yàn)相伴概率（Asymp. Sig.）P=0.667，單側(cè)檢驗(yàn) P=0.333 5，大于顯著性水平0.05，因此分別檢測廣西牛糞、牛肝樣品的HEV檢測陽性率差異不顯著。

表1 廣西8個市樣品牛HEV檢測結(jié)果

表2 分別檢測廣西6個市牛糞、4個市牛肝樣品的HEV檢測結(jié)果

3 討論

對廣西8個市牛糞、肝樣品HEV RNA檢測結(jié)果表明，梧州市樣品牛HEV陽性率很高，為72.73%（16/22）；而百色市樣品牛HEV陽性率為0%（0/26）。對廣西8個市樣品牛HEV陽性率差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果P＜0.05，表明廣西8個市牛HEV感染率的差異顯著。這可能與檢測樣品的數(shù)量、樣品的代表性有關(guān)，也可能與廣西這8個市的地形環(huán)境、氣候條件、養(yǎng)牛業(yè)狀況及牛相關(guān)產(chǎn)品流通等因素的差異有關(guān)。

應(yīng)用RT-nPCR從廣西6個市牛糞樣品中檢出HEV的陽性率為19.13%（35/183），從廣西4個市牛肝樣品中檢出HEV的陽性率為20%（5/25）。對兩種不同樣品檢出HEV陽性率的差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果P＞0.05，表明從兩種樣品檢出HEV的陽性率差異不顯著。而且從牛糞檢測HEV RNA較之從牛肝檢測HEV RNA有2個優(yōu)點(diǎn)：（1）牛糞可方便地采樣，不用殺牛取肝，牛糞的采樣成本很低；（2）牛糞可直接稀釋離心取上清用于檢測，而牛肝則需磨碎、凍融處理后離心取上清用于檢測，牛糞樣品處理較為簡易。所以牛糞HEV RNA檢測更適于作為牛群HE的病原監(jiān)測手段。

[1] 王彤. 醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)與SPSS軟件應(yīng)用[M]. 北京： 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社， 2008.

[2]li W, She R, Wei H, et al. Prevalence of hepatitis E viurs in swine under different breeding enviromnent and abattoir in Beijing, China[J]. Vet Microbial, 2009,133(1/2):75-83.