李儒曙 ，蘇惠龍 ，楊傲冰 ，禹思宇 ，黃 巖 ，向 華 ，張健騑

（1.珠海市動(dòng)植物防疫監(jiān)督檢驗(yàn)中心，廣東 珠海 519000；2.珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東珠海 519000；3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510000）

豬瘟是由豬瘟病毒（CSFV）引起的一種高度接觸性傳染病，豬瘟對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害嚴(yán)重，可造成巨大損失，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為法定報(bào)告?zhèn)魅静?。本病在?guó)內(nèi)大規(guī)模暴發(fā)基本停止，但是在全國(guó)各地仍有不間斷的散發(fā)。豬瘟的流行和發(fā)病特點(diǎn)近年來也已發(fā)生了很大變化，其流行形式已從頻發(fā)的大流行轉(zhuǎn)變?yōu)橹芷谛?、波浪形的地區(qū)性散發(fā)性流行，通常3~4年一個(gè)周期，疫點(diǎn)顯著減少，多局限于所謂“豬瘟不穩(wěn)定地區(qū)”散發(fā)性流行造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。因此，豬瘟仍然是危害養(yǎng)豬業(yè)的頭號(hào)大敵，在近年“高熱病”肆虐的背景下，研究豬瘟的防制以及豬瘟病毒的遺傳進(jìn)化具有重大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義。

豬瘟病毒遺傳分型是追蹤C(jī)SFV傳播、變異以及持續(xù)性感染等極為有效的方法，CSFV的E2基因是國(guó)際上通用的用來進(jìn)行豬瘟病毒遺傳分型的區(qū)域之一[2-3]。對(duì)現(xiàn)存市面上的豬瘟活疫苗毒株和流行于廣東省內(nèi)的豬瘟野毒株E2基因進(jìn)行序列測(cè)定、遺傳分型和比較分析，進(jìn)而找出各毒株之間主要抗原結(jié)構(gòu)差異與免疫保護(hù)的相關(guān)性，為控制豬瘟提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料樣品 豬瘟陽性可疑病料（組織21份、血清50份）于2006—2009年采自廣東省內(nèi)，由廣東永順生物制藥有限公司技術(shù)服務(wù)部、佛山科技學(xué)院、廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所豬病研究室和華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室提供。疫苗毒株為市面上購買的不同廠家產(chǎn)品。

1.2 主要試劑、質(zhì)粒載體及引物 提取總RNA所用裂解液Trizol為Invitrogen公司產(chǎn)品；cDNA第一鏈合成試劑盒、PCR試劑盒、質(zhì)粒載體pMD18-T、DNA Marker DL2000均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；E.coli DH5α工程菌為北京鼎國(guó)生物科技公司。根據(jù)GenBank收錄的豬瘟病毒全基因組序列，通過軟件評(píng)價(jià)，采用中國(guó)獸藥監(jiān)察所公開發(fā)表的一對(duì) 引 物[4]，P ：5'-CTGGTAACTGGGGCACAAG-3'、5'-GCAGTAGTATCCATTTCTTTAT-3'擴(kuò)增區(qū)域包括E2基因ABCD編碼區(qū)、E2基因5' 端的部分信號(hào)肽序列和3' 端的跨膜區(qū)（TMR）序列。

1.3 樣品處理 組織樣品：無菌取待檢病料（脾臟、淋巴結(jié)或扁桃體）100 mg，剪成碎塊，制成組織勻漿，低速離心后取上清。血液樣品：4 000 r/min以下冷凍離心取上清，或常溫靜置讓血清自然析出。疫苗毒樣品：用PBS溶液稀釋后取上清。

1.4 豬瘟病毒E2全基因的克隆 取處理好的樣品200 μL 加入 800 μL的 Trizol?LS Reagent裂解液，總RNA的抽提以及RT-PCR按照試劑說明書操作，PCR反應(yīng)結(jié)束后取反應(yīng)產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果?；厥漳康臈l帶，將純化的PCR產(chǎn)物與載體pMD18-T-載體進(jìn)行連接反應(yīng)，CaCl2法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α。經(jīng)PCR菌液鑒定為陽性的克隆，送上海生工生物工程公司測(cè)序。

1.5 CSFV廣東流行株遺傳分型及生物信息學(xué)分析

測(cè)序結(jié)果經(jīng)MegAlign軟件分析，確定本研究所測(cè)野毒株的遺傳分型，并參考Genbank中已發(fā)表的相關(guān)序列繪制系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)生樹。運(yùn)用DNAStar中相關(guān)軟件模塊對(duì)本研究中所測(cè)野毒株序列和疫苗株序列作核苷酸和氨基酸的相似性比對(duì)，以及蛋白在分子親水性、分子表面氨基酸殘基的分布特征、柔性、抗原性差異等方面比較。

2 結(jié)果

2.1 豬瘟病毒E2全基因的RT-PCR結(jié)果

從三個(gè)疫苗廠家4個(gè)批次的豬瘟病毒兔化弱毒疫苗以及來自茂名、佛山、珠海、惠州、廣州的6份組織樣品中分別擴(kuò)增出約1.3 kb大小的特異性條帶，與預(yù)計(jì)產(chǎn)物大小相符。經(jīng)菌液PCR鑒定、測(cè)序確證后提交GenBank，將本研究中這6個(gè)野毒株擴(kuò)增的E2基因片段按分離地分別編號(hào)為“Huizhou06 （GenBank登錄號(hào)：HQ697222）”、“Foshan08 （GenBank登錄號(hào) ：HQ697224） ”、“Guangzhou06（GenBank 登錄 號(hào) ：HQ697225）”、“Guangzhou09（GenBank 登錄 號(hào) ：HQ697223）”、“Maoming07（GenBank 登錄 號(hào) ：HQ697227）”、“Zhuhai07（GenBank 登 錄號(hào)：HQ697228）”。將不同廠家的疫苗毒分別編號(hào)為“VYS”、、“VDHN”、“VZM”、“VZM1”。

2.2 豬瘟病毒E2全基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 豬瘟病毒的遺傳分型（Genetic Typing）

對(duì)25株豬瘟病毒E2基因的完全或部分序列進(jìn)行序列比對(duì)，這25個(gè)病毒序列分別是本研究測(cè)得的10個(gè)病毒基因序列，以及GenBank中調(diào)用的15個(gè)國(guó)內(nèi)外公開發(fā)表的毒株序列，其中引用的國(guó)內(nèi)發(fā)表序列主要是廣東周邊省份上世紀(jì)末和本世紀(jì)初分離的毒株序列，并參照5個(gè)國(guó)外參考毒株序列Alfort187（subgroup1.1）、Brescia（subgruop1.2）、s7D2（subgroup2.1）、c4D（subgroup2.2）、n5W（subgroup2.3），繪制進(jìn)化發(fā)生樹。系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)生樹顯示本研究中病毒基因分型結(jié)果顯示所測(cè)豬瘟病毒廣東野毒株全部分布在2.1亞群；所測(cè)疫苗毒株位全部屬于1.1亞群。

2.2.2 8株CSFV核苷酸和氨基酸的相似性、趨異性比對(duì)

運(yùn)用DNAStar MegAlign對(duì)5個(gè)豬瘟病毒廣東野毒株基因序列、2個(gè)疫苗毒株基因序列和Shimen經(jīng)典強(qiáng)毒株基因序列進(jìn)行核苷酸和氨基酸的相似性比較。其中豬瘟疫苗株序列VYS與國(guó)外所測(cè)的C株序列C-strain（Moormann）核苷酸同源性為98.7%、氨基酸同源性為99.1%。本試驗(yàn)所測(cè)的四個(gè)國(guó)內(nèi)豬瘟疫苗株的核苷酸同源性均為在99.0%以上，氨基酸的同源性均在98.8%以上；其中來源于同一個(gè)廠家的 “VZM”、“VZM1”兩個(gè)毒株的核苷酸的同源性為99.6%，氨基酸的同源性為99.5%。

6個(gè)廣東野毒株與VYS株相比， 核苷酸的相似性從高到低為：Maoming07（82.5%）>Foshan08（82.2%）>Zhuhai07（82.0）> Huizhou06（81.8%）=Guangzhou09（81.8%）>Guangzhou06（80.9%）；氨基酸的相似性從高到低為：Maoming07（89.6%）=Zhuhai06（89.6%）>Guangzhou09（89.4%）>Huizhou06（88.9%）>Foshan（88.4%）>Guangzhou06（83.3%）。

6個(gè)野毒株與Shimen株相比，核苷酸的相似性 從 高 到 低 為 ：Maoming07（83.7%）>Foshan08（83.3%）>Zhuhai07（82.7）= Huizhou06 （82.7%）>Guangzhou09（82.5%）>Guangzhou06（81.2%）；氨基酸的相似性從高到低為：Zhuhai07（91.0%）>Maoming07（90.8%）=Guangzhou09（90.8%）>Huizhou06（90.1%）>Foshan08（89.4%）>Guangzhou06（85.6%）

2.2.3 分子親水性、蛋白質(zhì)骨架柔韌性、抗原性的差異

通過生物信息學(xué)軟件DNAStar Protean分析比較5個(gè)豬瘟病毒廣東野毒株和疫苗株E2蛋白在分子親水性、蛋白質(zhì)骨架柔韌性、抗原性的差異。E2蛋白在分子親水性、抗原性具有較高的相似性；在蛋白質(zhì)骨架的柔韌性方面有一定的相似性，同時(shí)也存在著一定的差異性。

2.2.4 跨膜疏水區(qū)（TMR）的差異性分析

在TMR序列中，6個(gè)野毒株在圖中標(biāo)尺中382、400、412、413四處氨基酸對(duì)應(yīng)均為Q、N、I、I，而疫苗株和Shimen強(qiáng)毒株在此四處對(duì)應(yīng)氨基酸均為P、I、V、M。這四處是不是2.1亞群和1.1亞群之間的遺傳標(biāo)記有待研究并值得所有研究者關(guān)注。

3 討論

豬瘟病毒毒株間的差異取決于所比較的基因組靶區(qū)域的長(zhǎng)度和變異性。關(guān)于豬瘟病毒基因組的哪一區(qū)域用來進(jìn)行遺傳比較更科學(xué)，哪一種比較方法最有意義目前尚有爭(zhēng)議。5'NTR、E2和NS5B基因是CSFV遺傳分型時(shí)應(yīng)用最廣泛的基因組區(qū)域，對(duì)這三種分型方法結(jié)果進(jìn)行分析比較，證實(shí)利用NS5B進(jìn)行遺傳分型的可信度最高，5'NTR的可信度最低[5]。雖然普遍認(rèn)為采用NS5B基因序列進(jìn)行豬瘟病毒的遺傳分型具有較高的置信度，但由于E2片段的易變性，采用E2基因序列進(jìn)行遺傳分型在保證一定的置信度的同時(shí)卻有更好的區(qū)分度。為了保持世界各地序列數(shù)據(jù)的一致性，國(guó)外以E2基因?qū)ωi瘟病毒分型通常采用德國(guó)漢諾威豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室公開發(fā)表的一對(duì)引物：5'-TCRWCAACCAAYGAGATAGGG-3'（Alfort株 基因組的2467-2487位）、5'-CACAGYCCRAAYCCRA AGTCATC-3'（Alfort株基因組的2738-2716位株其因組的），擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為190 bp[3]。筆者認(rèn)為190 bp的片段長(zhǎng)度相對(duì)于完整E2片段長(zhǎng)度來說，擴(kuò)增的區(qū)域較短，而采用序列比對(duì)的方法對(duì)病毒進(jìn)行遺傳分型時(shí)，比對(duì)的序列越長(zhǎng)越有利于不同毒株的區(qū)分。本研究擴(kuò)增的6個(gè)野毒株和4個(gè)疫苗毒株序列均為1 273 bp，包括了豬瘟病毒完整的E2基因序列，這些序列的獲得使不同毒株的進(jìn)化分析具有較高的置信度和區(qū)分度。由于病毒的變異性，采用簡(jiǎn)并引物更能有效地進(jìn)行PCR擴(kuò)增，本研究所采用的引物為非簡(jiǎn)并引物，這大概是本實(shí)驗(yàn)在RT-PCR檢測(cè)豬瘟可疑病料過程中有效擴(kuò)增率較低的原因。毒株的數(shù)量越大，得到的序列越多，越能有效說明問題[5]。但從大量“高熱病”和“疑似豬瘟”的病料中，我們只有效擴(kuò)增了6個(gè)CSFV野毒序列。雖有效擴(kuò)增數(shù)目偏少，對(duì)反映各毒株之間的關(guān)系以及病毒流行等相關(guān)問題有一定的局限性，但另一方面可以說明“高熱病”的復(fù)雜性，此結(jié)果對(duì)我們探討“高熱病”與豬瘟的關(guān)系有一定的參考價(jià)值。

本研究所測(cè)6株豬瘟野毒均為2.1亞群，可以推測(cè)近年廣東省流行的豬瘟病毒主要以2.1亞群為主。廣東省目前是我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；?、集約化程度最高的省份之一，與外省在種豬、生豬、豬苗等方面的交易都非?；钴S，從而造成廣東省豬瘟病毒毒株的復(fù)雜性和多樣性，從這個(gè)意義上說，廣東省流行的病毒毒株具有一定的代表性，廣東省流行毒株可以間接反映全國(guó)特別是華南地區(qū)毒株的流行情況。本研究的結(jié)果與Tu等的研究結(jié)果一致[6]，即豬瘟病毒2.1亞群基因型在我國(guó)流行毒株中占有最大的比重。

本研究測(cè)得的適應(yīng)于牛睪丸細(xì)胞培養(yǎng)的豬瘟病毒疫苗株VYS與國(guó)外早年測(cè)得的豬瘟病毒C株相比，核苷酸的同源性為98.7%，氨基酸的同源性為99.1%；國(guó)內(nèi)四個(gè)不同廠家的豬瘟病毒疫苗株之間無論是核苷酸還是氨基酸也具有極高的相似性，說明C株細(xì)胞疫苗毒的主要保護(hù)性抗原蛋白（gp55）基因遺傳穩(wěn)定，微小的趨異性可能是由于病毒傳代的代次不同造成的。豬瘟病毒疫苗株VYS與6株豬瘟病毒廣東野毒株相比，核苷酸的相似性為82.5%~80.9%，氨基酸的相似性為89.6%~83.3%；豬瘟病毒Shimen經(jīng)典強(qiáng)毒株與這6個(gè)野毒株相比，核苷酸的相似性為83.7%~81.2%，氨基酸的相似性為91.0%~85.6%。中國(guó)獸藥監(jiān)察所對(duì)22株不同年代CSFV E2基因部分編碼序列作同源性比較，發(fā)現(xiàn)其中13株CSFV流行毒株的核苷酸和氨基酸的同源性范圍分別為78.1%~100%、78.4%~100%，4株70~80年代分離的毒株的核苷酸和氨基酸的同源性范圍分別為79.0%~88.3%、81.1%~87.8%，9株90年代分離的毒株的核苷酸及氨基酸同源性范圍分別為80.8%~100%、83.8%~100%[7]。其結(jié)果與本研究的結(jié)果比較接近，說明CSFV流行株的變異呈現(xiàn)一定的多樣性，隨著時(shí)間的推移，不是只向遠(yuǎn)離疫苗株的方向變異，也不是向經(jīng)典強(qiáng)毒株的方向變異。李紅衛(wèi)[8]、韓雪清[9]等關(guān)于我國(guó)豬瘟流行毒株已向遠(yuǎn)離疫苗毒株的方向變化的結(jié)論與本研究的試驗(yàn)結(jié)果不符。

在這6個(gè)廣東野毒株、4個(gè)疫苗株和Shimen株的序列中也都含有一段非常保守的氨基酸序列ALNVVSRRYLASLHK，11株病毒在此處都沒有發(fā)生氨基酸變異，對(duì)這段保守氨基酸進(jìn)行抗原性及疏水性分析，均為親水性，且抗原性指數(shù)在整個(gè)E2抗原譜中最高，其位置正好位于E2基因最具抗原性的B區(qū)和C區(qū)，而B、C區(qū)是誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體最為重要的部分。Lowings等[3]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞受體序列中也有極為類似的保守區(qū)RYLAIVH，因此推測(cè)該段保守性氨基酸除了與豬瘟病毒和宿主細(xì)胞的親嗜性以及宿主范圍有關(guān)外，還對(duì)E2糖蛋白抗原性起決定作用[4]。如果這種推測(cè)是正確的，那么疫苗的穩(wěn)定性和有效性將得到解釋。

分析比較6個(gè)豬瘟病毒廣東野毒株和疫苗株E2蛋白在分子親水性、抗原性的差異，發(fā)現(xiàn)它們之間保持較高的相似性。通過軟件分析可以比較直觀地看出所測(cè)毒株在某些相同的肽段親水性指數(shù)和抗原性指數(shù)均較高，具有較高的相似性。而6個(gè)野毒株與疫苗株E2蛋白在蛋白質(zhì)骨架的柔韌性方面有一定的相似性，也存在著一定的差異性，表明E2肽段的二級(jí)結(jié)構(gòu)有較大的相似性，局部的差異可能導(dǎo)致高級(jí)結(jié)構(gòu)的折疊有部分差異。這種高級(jí)結(jié)構(gòu)的部分差異會(huì)不會(huì)影響疫苗免疫對(duì)野毒攻擊的保護(hù)效果值得研究。當(dāng)然相似性略有差異的片段也有可能在功能上不會(huì)有差別，它們的差異可能來自非抗原決定簇的位點(diǎn)變異。我們假設(shè)認(rèn)為E2肽段在抗原性和疏水性上與疫苗毒沒有顯著區(qū)別，影響抗原性的抗原決定簇的結(jié)構(gòu)不會(huì)發(fā)生顯著變化，那么疫苗毒產(chǎn)生的中和抗體對(duì)豬群的保護(hù)是相當(dāng)有效的。

位于C端TMR（1030-1063）是一段保守序列，這段跨膜疏水序列對(duì)誘發(fā)高效價(jià)中和抗體和產(chǎn)生完全免疫保護(hù)非常重要[10]，有研究證實(shí)，用含有完整E2基因重組疫苗免疫豬所產(chǎn)生的中和抗體效價(jià)比不含TMR的重組疫苗產(chǎn)生的抗體效價(jià)高很多，并且前者抗體產(chǎn)生的速度也較快。所測(cè)的10株病毒的E2糖蛋白的TMR是完整的，且均形成4個(gè)疏水區(qū)，該疏水性結(jié)構(gòu)對(duì)E2蛋白的穿膜作用十分重要，且使得E2糖蛋白鑲嵌在囊膜上十分牢固。野毒株和疫苗株的TMR具有一定的穩(wěn)定性，從一方面保證了誘發(fā)中和抗體的穩(wěn)定性。

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所做了豬瘟兔化弱毒疫苗對(duì)動(dòng)物性保護(hù)性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明疫苗對(duì)感染豬瘟病毒2.1亞群、2.2亞群的豬具有完全的保護(hù)性[6]。而廣東省主要以豬瘟病毒2.1亞群流行為主，因此推測(cè)疫苗對(duì)目前廣東省的豬瘟防控是有效的。

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