王慧珊 ，高志強 ，王金寶 ，張鶴曉 ，喬彩霞 ，吳亞瓊 ，邢佑尚 ，朱淑芬

（1. 青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東 青島，266109；2. 北京出入境檢驗檢疫局，北京 通州，101113；3. 山東省農(nóng)業(yè)科學院，山東 濟南，250100；4. 山東農(nóng)業(yè)大學，山東 泰安，271018）

豬傳染性胃腸炎（TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）引起的一種高度接觸傳染性腸道疾病，臨床上以病豬嘔吐、嚴重腹瀉和失水為主要特征，不同品種、年齡的豬只都可感染發(fā)病，尤以兩周齡以內(nèi)仔豬、斷奶仔豬易感性最強，致死率高，可達100%[1]。該病是一種世界性疾病，給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟損失，早發(fā)現(xiàn)、早確診對該病的防治意義重大。要做到早確診就需要快速、敏感、特異的診斷方法。

目前，檢測TGEV的常規(guī)方法主要有病毒分離鑒定、病毒中和試驗、免疫熒光抗體試驗、電鏡觀察、免疫電鏡觀察、ELISA方法[2]、核酸探針雜交技術(shù)[3]、普通RT-PCR技術(shù)[4]、多重RT-PCR技術(shù)等。這些方法在過去對豬傳染性胃腸炎的防制和診斷上起到了重要的作用，但是這些技術(shù)要么操作繁瑣，周期長，要么靈敏性差，只能進行定性檢測而不能定量分析。實時熒光定量RT-PCR技術(shù)具有高敏感性、高特異性、高精確定量和方便快捷等優(yōu)點，非常適用于病毒感染的檢測，尤其是感染早期檢測。為此我們建立了針對TGEV的TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法，為TGEV感染的早期診斷及流行病學調(diào)查提供了一種簡便、快速、高效、敏感、特異的方法。

豬呼吸道冠狀病毒（PRCV）和TGEV在結(jié)構(gòu)上非常相似，同源性達96%以上，被認為是TGEV的自然突變株[5]。在基因結(jié)構(gòu)上，相比TGEV，PRCV只是S基因缺失了B、C兩個抗原位點，只針對保守基因N基因建立檢測方法可能會對PRCV造成錯檢。因此，本研究除針對保守基因設計引物探針，同時針對PRCV S基因的缺失位點設計引物探針來進一步區(qū)分PRCV和TGEV。

1 材料與方法

1.1 病毒株

滅活的豬傳染性胃腸炎病毒標準株P(guān)urdue P115、藍耳病病毒核酸、豬偽狂犬病毒核酸、豬呼吸道冠狀病毒核酸，均由本實驗室保存；豬鏈球菌2型分離株C55606核酸，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.2 主要試劑及儀器

Trizol，購自Invitrogen公司；Taq DNA聚合酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶， dNTP、RNA酶抑制劑等購自Promega公司。

主要儀器有臺式冷凍高速離心機（Eppendorf Centrifuge 5417R）；熒光定量 PCR儀（Roche Light CyclerⅡ）。

1.3 引物與探針的設計和合成

從GenBank登錄的TGEV分離株獲得不同基因型代表毒株的序列，利用DNAMAN基因分析軟件對其進行同源性分析，選擇序列中高度保守的區(qū)域作為熒光定量RT-PCR擴增的區(qū)域，利用Oligo6.3軟件設計引物和探針。本實驗針對保守基因N基因設計一對引物與Taqman探針，目的片段大小為144bp，同時針對S基因的B、C位點設計另一對引物與探針來區(qū)分TGEV與PRCV，目的片段為125 bp。

P1（N）： CTGAAAGGTGGTTCTTCTAC

P2（N ： CATTATTAGCACCACGACTA

Probe（N）：5'FAM-CCTTGGCAACCCAGACAA CTCC-TAMRA 3'

P1（S）：TCTGCTGAAGGTGCTATTAT

P2（S）：GAAGGACATATAGGGAACTTAT

Probe（S）：5'FAM-CACTCACTACCCCAATTGC AAGTC-TAMRA 3’

引物和探針均由大連寶生物工程有限公司合成。

1.4 病毒RNA的提取

按照Trizol（Invitrogen公司）說明書從TGEV細胞培養(yǎng)物中提取總RNA。

1.5 熒光RT-PCR反應條件的優(yōu)化

1.5.1 引物和探針濃度的優(yōu)化

將引物濃度從 0.1 μM 至 0.8 μM 以 0.1 μM 間隔遞增，探針濃度從 0.025 μM 至 0.2 μM 以 0.025 μM 遞增。對引物和探針不同濃度的配比進行比較。

1.5.2 Mg2+濃度的優(yōu)化

應用篩選好的引物探針，將Mg2+的濃度從1.5 mM至6.0 mM以0.5 mM間隔遞增。對不同Mg2+濃度條件下的擴增進行比較。

1.5.3 其它條件的優(yōu)化

應用篩選好的引物探針和Mg2+的濃度，進一步對Taq DNA聚合酶用量，多種逆轉(zhuǎn)錄酶，循環(huán)參數(shù)等條件進行優(yōu)化。

1.6 靈敏度試驗

將 提 取 的 RNA（8.97lgTCID50/0.01mL）作101~1010倍稀釋，進行TGEV熒光RT-PCR檢測，測定檢測極限。同時用常規(guī)RT-PCR檢測方法對其進行檢測，比較兩種檢測方法的靈敏性差異。

1.7 標準曲線的建立

對不同稀釋度TCID50病毒RNA按最佳條件進行熒光RT-PCR測定，并用去離子水作為陰性標準，對所獲得的Ct值作為定量參數(shù)對不同稀釋度的對數(shù)值做線性回歸。

1.8 特異性試驗

利用本實驗所建立的定量RT-PCR檢測方法對豬傳染性胃腸炎病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒、豬呼吸道冠狀病毒和豬鏈球菌同時進行檢測，設立陰、陽性對照，驗證方法的特異性。

1.9 重復性試驗

對3個不同濃度TCID50病毒核酸用所建立的檢測方法分別檢測3次，根據(jù)其Ct值求出變異系數(shù)，以驗證方法的可重復性和穩(wěn)定性。

1.10 臨床送檢樣品的檢測

對山東、遼寧等地3個豬場送檢的39份糞便樣品進行處理，提取RNA，應用熒光定量RT-PCR方法檢測。同時用常規(guī)RT-PCR方法進行檢測，并對結(jié)果和流行狀況進行分析。

2 結(jié)果

2.1 反應條件的優(yōu)化結(jié)果

經(jīng)過多次重復試驗優(yōu)化，建立反應體系：5×RTPCR buffer 5 μL，引 物 P1（N，10 μM）0.5 μL，引 物P2（N，10 μM）0.5 μL，探針 Probe（N， 10 μM）0.3 μL，dNTP（2.5 μM）2μL，M-MLV 反 轉(zhuǎn) 錄 酶 0.5 μL，RNA 酶抑制劑 0.25 μL，Taq酶 0.25 μL，RNA 模板10 μL，補水至 25 μL。對于進一步鑒別 TGEV 與 PRCV的檢測方法，建立反應體系：5×RT-PCR buffer 5 μL，引物 P1（S，10 μM），引物 P2（S，10 μM）各 0.75 μL，探 針 Probe（S，10 μM）0.4 μL，dNTP（2.5 μM）2 μL，M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 0.5 μL，RNA 酶抑制劑 0.25 μL，Taq 酶 0.25 μL，RNA 模板 10 μL，補水至 25 μL。

2.2 熒光定量RT-PCR反應參數(shù)的優(yōu)化

從多次重復性試驗中發(fā)現(xiàn)，該檢測方法最適循環(huán)參數(shù)為 42℃ /30 min，94℃ /3 min;94℃ /10 s，55℃/10 s，60℃/30 s;45個循環(huán)，60 ℃時收集熒光。

鑒別TGEV與PRCV的檢測方法最適循環(huán)參數(shù)為 42℃ /30 min，94℃ /3 min;94℃ /10 s，54℃ /10 s，60℃/30 s;45個循環(huán)，60℃時收集熒光。

2.3 靈敏度試驗

將病毒RNA進行10倍系列稀釋，兩個熒光定量RT-PCR檢測方法結(jié)果顯示檢測極限均可達0.61TCID50。圖1為傳染性胃腸炎病毒的靈敏度檢測結(jié)果。圖2為鑒別TGEV與PRCV的檢測方法的靈敏度結(jié)果。而普通RT-PCR檢測結(jié)果通過2.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示，前三個稀釋度為陽性，即檢測極限為61TCID50，（圖3）。由此可見熒光定量RT-PCR方法比普通RT-PCR方法敏感性約高100倍。

2.4 標準曲線的建立

通過測定每一稀釋度病毒RNA的Ct值，進而與原濃度的對數(shù)值線性回歸作圖。結(jié)果在所測定的濃度范圍內(nèi)，樣品的濃度與對應的Ct值呈現(xiàn)明顯的線性相關(guān)關(guān)系，其回歸曲線的斜率為-3.354 4，截距為32.928，相關(guān)系數(shù)R2為0.9965。鑒別TGEV與PRCV的檢測方法也呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)關(guān)系，回歸曲線斜率為-3.348，截距為34.173，相關(guān)系數(shù)R2為0.998 9。說明建立的檢測方法相關(guān)性良好，可以用于病毒RNA的定量檢測（圖 4、圖 5）。

2.5 特異性試驗

利用本實驗所建立的定量RT-PCR檢測方法對豬傳染性胃腸炎病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒、豬呼吸道冠狀病毒、豬鏈球菌進行檢測，結(jié)果TGEV與PRCV呈現(xiàn)陽性，其他均為陰性。再對其呈現(xiàn)陽性的用鑒別TGEV和PRCV的檢測方法進行進一步檢測，結(jié)果僅TGEV呈陽性，而PRCV則呈陰性。

2.6 重復性試驗

對不同濃度TCID50病毒核酸用所建立的檢測方法重復檢測3次，結(jié)果如表1，對通用檢測方法不同試驗獲得的Ct值標準差位于0.31~0.56，變異系數(shù)為1.0%~2.3%；如表2，對鑒別TGEV和PRCV的檢測方法，不同試驗獲得的Ct值標準差位于0.4~0.5，變異系數(shù)為1.3%~1.9%，證實所建立的方法重復性、穩(wěn)定性良好，可以滿足檢測的需要。

表1 TGEV對不同濃度TCID50RNA檢測的重復性

2.7 建立方法對臨床樣品的檢測結(jié)果

對3個豬場送檢的39份樣品進行熒光定量RTPCR檢測，并和普通RT-PCR檢測結(jié)果進行了對比，兩種方法檢測結(jié)果完全吻合，檢測結(jié)果的陽性率為20.5%（8/39）。說明國內(nèi)豬場里感染豬傳染性胃腸炎病毒比較普遍，情況較嚴重。

3 討論

熒光定量PCR是在PCR反應過程中通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號的強弱來即時測定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量。這是近幾年一種新型的核酸定性定量技術(shù)，靈敏度高，特異性好，又具有可實時監(jiān)測、速度快、操作簡單、污染少等優(yōu)點，是當前病毒、細菌檢測技術(shù)發(fā)展的一個新方向。根據(jù)采用的熒光材料不同，熒光定量PCR分為SYBR Green I染料法、TaqMan探針法、分子信標法、雜交探針法等[6]。其中，SYBR Green I染料與任何雙鏈DNA都可結(jié)合，容易產(chǎn)生非特異性熒光，而TaqMan探針法具有高特異性，與分子信標法等相比設計相對簡單，且重復性好，因此被普遍使用，本研究也使用本方法。

本試驗以TGEV N基因為靶基因序列設計了檢測TGEV的特異性引物和探針序列，建立了用于快速檢測TGEV的TaqMan探針熒光定量RT-PCR方法。但由于TGEV與PRCV具有很高的同源性，針對N基因為靶基因的檢測方法區(qū)別不出TGEV與PRCV，因此又建立了針對PRCV的缺失區(qū)域為靶基因的進一步的檢測方法，在檢測中，第一步檢測結(jié)果呈陽性時則進行第二步檢測，來區(qū)分TGEV與PRCV，提高了檢測TGEV的準確性。本方法的檢測敏感性達到0.61TCID50，與常規(guī)RT-PCR檢測方法相比，靈敏度高100倍，且假陽性低，不易污染，擴增與檢測一步完成，不需要對產(chǎn)物進行電泳等后期處理，操作更簡便。

利用本試驗建立的TaqMan探針熒光定量RTPCR檢測方法，可以對豬傳染性胃腸炎病毒感染發(fā)病豬早期進行快速檢測、流行病學調(diào)查和實時監(jiān)測，具有重要的臨床實用意義。

[1] Straw B E，Daiiaire S，Mengeling W I，et a1. Diseases of Swine[M].8th. Iowa：Iowa State University Press，1999：295-325.

[2] Carman S， Josephson G. Field validation of a commercial blocking ELISA to differentiate antibody to transmissible gastroenteritis virus（TGEV）and porcine respiratory coronavirus and to identify TGEV-infected swine herds [J]. Vet Diagn Invest，2002，14（2）：97-105.

[3] Ba I， Jackwood D J， Benfield D A. Differentiation of transmissible gastroenteritis virus from porcine respiratory coronavirus and other antigenically related coronaviruses by using cDNA probes specifi c for the 5 region of the S glycol-protein gene[J]. J Clin Microbiol，1991，29（1）：215-218.

[4] 賈赟，胡傳偉，簡中友，等.檢測豬傳染性胃腸炎病毒RTPCR方法的建立[J].檢驗檢疫科學，2006，16（4）：12-15.

[5] CHAE C， KIM O， MIN K， et al. Seroprevalence of porcine respiratory coronavirus in selected Korean pigs [J]. Prev Vet Med，2000，46（4）：293-296.

[6] 陽成波，印遇龍，黃瑞林，等.實時定量RT-PCR的原理及方法[J].免疫學雜志，2003，19（3）： 145-150.