李本硯,熊緒杰
(黃岡師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,湖北黃州438000)
熒光探針在植物激素檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展
李本硯,熊緒杰*
(黃岡師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,湖北黃州438000)
本文綜述了熒光探針在植物激素檢測(cè)方面的一些應(yīng)用現(xiàn)狀,如熒光探針用于檢測(cè)茉莉酸、脫落酸、油菜素類固醇和多胺等。
熒光探針;植物激素;標(biāo)記試劑
分析中的探針一般指能和特異靶分子發(fā)生相互作用,實(shí)現(xiàn)對(duì)靶分子檢測(cè)的分子或試劑。熒光探針是以熒光物質(zhì)作為指示劑,并在一定波長(zhǎng)光的激發(fā)下使指示劑產(chǎn)生熒光,通過檢測(cè)所產(chǎn)生的熒光實(shí)現(xiàn)對(duì)被檢測(cè)物質(zhì)的定性或者定量分析的分子或試劑[1]。熒光探針按照與靶分子的相互作用方式有靜電引力、疏水作用、化學(xué)鍵合?;瘜W(xué)鍵合型熒光探針一般由兩部分組成:熒光團(tuán)和反應(yīng)基團(tuán)。反應(yīng)基團(tuán)與目標(biāo)分子某些活性基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng),形成化學(xué)鍵;熒光團(tuán)使標(biāo)記后的分子呈現(xiàn)熒光。由于化學(xué)鍵合型熒光探針與目標(biāo)分子形成的化學(xué)鍵一般比較牢固,可以與高效液相色譜、毛細(xì)管電泳等分離手段相結(jié)合,實(shí)現(xiàn)混合體系的高效分離與熒光檢測(cè),在復(fù)雜體系的超痕量物質(zhì)的分析中具有廣泛應(yīng)用。
植物激素是植物體內(nèi)的微量信號(hào)分子,它們對(duì)植物生長(zhǎng)、發(fā)育以及植物應(yīng)對(duì)外界生物與非生物脅迫起重要作用。植物體內(nèi)植物激素的濃度以及組織對(duì)植物激素敏感性的變化控制了植物的整個(gè)發(fā)育進(jìn)程。自1926年荷蘭植物學(xué)家弗里茨·溫特(Frits Went)從燕麥胚芽鞘中分離出第一種植物激素吲哚乙酸(auxin)以來,越來越多植物激素相繼被發(fā)現(xiàn)。按它們的結(jié)構(gòu)可以分吲哚類(auxin)、細(xì)胞分裂素類(cytokinins)、脫落酸類(abscisic acid)、赤霉素類(gibberellins)、乙烯(ethylene)、茉莉酸類(jasmonates)、水楊酸(salicylic acid)、油菜素類固醇(brassinolides)、生物多胺以及系統(tǒng)素(oligopeptide systemin)等[2,3]。
植物激素大多含有特殊官能團(tuán),如吲哚類、茉莉酸類、脫落酸類等含有羧基;茉莉酸、茉莉酸甲酯、脫落酸等含有羰基;油菜素內(nèi)酯含有鄰二羥基、多胺及系統(tǒng)素含有氨基。這些官能團(tuán)可以被特定的熒光探針標(biāo)記。本文就熒光探針在植物激素檢測(cè)中的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行探討和總結(jié)。
含有羧基的植物激素有吲哚類、茉莉酸類、脫落酸類、苯氧乙酸類,這些激素盡管有的含有較大共軛體系,但采用紫外檢測(cè)法測(cè)定的靈敏度仍不理想,選擇性也不好,并且不同激素用同一種檢測(cè)波長(zhǎng)會(huì)犧牲某些激素檢測(cè)的靈敏度。采用熒光標(biāo)記是提高靈敏度和選擇性的有效途徑。9-重氮甲烷蒽(9 -anthryldiazomethane,ADAM)[4]和5 -溴甲基熒光素(5-bromomethylfluorescein,5-BMF)[5]曾用于標(biāo)記茉莉酸的羧基并結(jié)合高效液相色譜分離檢測(cè)茉莉酸。ADAM與茉莉酸在4°C進(jìn)行衍生反應(yīng),反應(yīng)需避光放置一晚。對(duì)茉莉酸和二氫茉莉酸的檢測(cè)限分別為2.9 ng mL-1和3.7 ng mL-1(進(jìn)樣量50μL)。ADAM雖然能取得較好的靈敏度性和重現(xiàn)性,但由于重氮甲烷類試劑不穩(wěn)定,需要在線合成,衍生需要避光、無水衍生條件,因而使用不是很方便。5-BMF用于毛細(xì)管電泳激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)茉莉酸,靈敏度達(dá)10amol,并且樣品前處理相對(duì)簡(jiǎn)單,只需將植物組織萃取后濃縮至干就可直接衍生,衍生反應(yīng)在60°C反應(yīng)60 min,因而前處理具有一定的優(yōu)勢(shì)。但衍生濃度并不具有優(yōu)勢(shì),其衍生濃度限僅為0.5 μmol L-1[5]。以上兩種試劑都要無水衍生條件,將植物萃取液氮?dú)獯蹈桑?]或真空濃縮至干[5]。
含有羰基的植物激素主要有茉莉酸、二氫茉莉酸、茉莉酸甲酯、二氫茉莉酸甲酯、脫落酸以及某些油菜素類固醇。Anderson[6]首次將熒光肼試劑用于茉莉酸類植物激素分析,比較了幾種常用的用于衍生羰基的肼試劑,發(fā)現(xiàn)丹磺酰肼具有較高的靈敏度,因此該試劑被用于同時(shí)測(cè)定植物中的茉莉酸、二氫茉莉酸、茉莉酸甲酯、二氫茉莉酸甲酯和脫落酸。但衍生過程中采用了高濃度的強(qiáng)酸性催化劑,約20%的茉莉酸轉(zhuǎn)化為茉莉酸甲酯,給定量帶來麻煩。此外,丹磺酰肼還用于6位含有羰基的油菜甾醇類植物激素的生物合成中間體測(cè)定[7]。Liu 等[8]以8 -氨基 -1,3,6 -三磺酸基芘(APTS)為熒光試劑對(duì)脫落酸進(jìn)行標(biāo)記,APTS與脫落酸的羰基反應(yīng)形成肼,然后采用氰基硼氫化鈉進(jìn)一步還原為胺后可以比較穩(wěn)定,結(jié)合毛細(xì)管電泳激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè),檢測(cè)限達(dá)5.5 amol,衍生的濃度限也達(dá)到 2.8 × 10-8mol l-1。該方法具有較好的選擇性和靈敏度,萃取的樣品不需要進(jìn)一步純化和富集。熊[9]合成了以1,3,5,7-四甲基-8丁酰肼二氟化硼二吡咯甲烷為熒光標(biāo)記試劑,該試劑與羰基化合物的衍生產(chǎn)物熒光量子產(chǎn)率高達(dá)0.94(乙腈),該試劑激發(fā)波長(zhǎng)為495 nm,最大發(fā)射波長(zhǎng)為505 nm。試劑對(duì)茉莉酸具有較好的反應(yīng)活性和選擇性,在60衍生30 min即可衍生完全,標(biāo)記后采用高效液相色譜分離熒光檢測(cè),具有很高的靈敏度,線性范圍,檢測(cè)限達(dá),是目前所有檢測(cè)茉莉酸方法中靈敏度最高的。進(jìn)一步的研究表明該試劑標(biāo)記茉莉酸甲酯和茉莉酸二氫甲酯需要在80°C反應(yīng)2.5 h,也能進(jìn)行很好的檢測(cè),只不過在該衍生條件下,試劑分解產(chǎn)生雜質(zhì)峰,雖然不影響茉莉酸甲酯和茉莉酸二氫甲酯的分離,但卻不能同時(shí)檢測(cè)茉莉酸、二氫茉莉酸和脫落酸。
生物多胺是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì),其代表有尸胺、腐胺、精胺和亞精胺。由于它們都含有游離的氨基,可以被氨基活性的熒光標(biāo)記試劑所標(biāo)記。對(duì)生物胺進(jìn)行熒光標(biāo)記測(cè)定的試劑主要有丹磺酰肼(Dns-Cl)、鄰苯二醛(OPA)、異硫氰基熒光素(FITC)、芴甲氧基碳酰氯(FMOC-Cl)等,這些試劑用于生物胺的測(cè)定也各有其優(yōu)缺點(diǎn)[10]。最近,Li等[11]采用 1,3,5,7-四甲基-8-苯基-(4'-O-(N-琥珀酰亞胺乙酸酯))-二氟化硼-二吡咯甲烷(TMPABOSu)作為熒光衍生試劑,測(cè)定了蘋果中的5種生物胺,苯乙胺(Phe)、亞精胺(Spd)、精胺(Spm)、腐胺(Put)、尸胺(Cad)。該方法樣品前處理簡(jiǎn)單,衍生方法溫和,只需將萃取后的樣品過濾后直接在45°C下衍生5 min,衍生好的樣品直接進(jìn)樣分析。方法的檢測(cè)限為2-80fmol。Cao等[12]采用6-氧-[(1-琥珀酰亞胺)氧酰甲基]-熒光素乙酯(6-oxy-(N-succinimidyl acetate)-9-(2’– methoxycarbonyl)fluorescein)為熒光衍生試劑,采用膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)測(cè)定了8種典型生物胺,方法的檢測(cè)限為0.25– 2.5 nmol/L。其他方法見綜述[13]。
高油菜素內(nèi)酯是油菜素類固醇植物激素的一員,其分子的12,13位含有垂直的鄰二羥基,可以采用基于標(biāo)記鄰二羥基的熒光試劑。目前用到的熒光試劑有9-菲硼酸(9-phenanthreneboronic acid)、1-氰基-2-間苯硼酸-異吲哚(1-cyanoisoindole-2-m -phenylboronic acid)、丹磺酰氨基苯硼酸((dansylamino)phenylboronic acid)等[14]。檢測(cè)限與所用的試劑有很大關(guān)系,大致在25 to 100 pg之間。這些試劑中以丹磺酰氨基苯硼酸最具有優(yōu)勢(shì),因?yàn)槠浒l(fā)射波長(zhǎng)在500 nm以上,Stock位移大(激發(fā)345 nm,發(fā)射515 nm),植物樣品基質(zhì)產(chǎn)生的干擾較少。丹磺酰氨基苯硼酸與高油菜素內(nèi)酯的衍生產(chǎn)物可以采用乙腈-水體系在C18柱上有效分離[15]。
盡管其他一些方法如氣相色譜-質(zhì)譜(GC/MS)[16]、液相色譜 - 質(zhì)譜/質(zhì)譜(HPLC - MS/MS)也用于植物激素的檢測(cè)[17],但這些方法一般需要較為復(fù)雜的樣品前處理程序,并且設(shè)備昂貴,運(yùn)行成本較高。由于熒光探針具有標(biāo)記反應(yīng)的選擇性和熒光檢測(cè)的高靈敏性,不失為一種較好的檢測(cè)方法。該方法的發(fā)展有賴于靈敏度高、標(biāo)記性能優(yōu)良的熒光探針的開發(fā)。植物激素?zé)晒馓结樀拈_發(fā),一方面是針對(duì)某一類植物激素開發(fā)熒光探針和開發(fā)分析方法;另一方面是以某一熒光團(tuán)開發(fā)一系列標(biāo)記不同基團(tuán)的熒光探針,這樣可以采用相同的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)實(shí)現(xiàn)不同類型植物激素的同時(shí)測(cè)定,便于研究不同類植物激素之間的相互作用關(guān)系(如協(xié)同或抗拮)。此外將熒光探針作為植物激素的示蹤指示劑,研究植物激素在植物體內(nèi)的遷移和作用機(jī)理也將會(huì)有一定的用途。
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Review on the progress of fluorescent probes in determining of plant hormones
LI Ben-yan,XIONG Xu-jie
(College of Chemistry and Life Science,Huanggang Normal University,Huangzhou 438000,Hubei,China)
This paper reviews the recent progress of fluorescent probes in the determination of plant hormones,for example,the method was used to detect jasmonic acid,abscisic acid,brassinosteroid and polyamine,etc.
fluorescent probe;plant hormone;labeling reagent
O652.3
A
1003-8078(2011)06-0069-03
2011-06-18 doi10.3969/j.issn.1003 -8078.2011.06.20
李本硯,男,湖北荊州人,黃岡師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院應(yīng)化0901班學(xué)生,申請(qǐng)大學(xué)生科研助手。
黃岡師范學(xué)院自然科學(xué)基金(05CA29);黃岡師范學(xué)院博士基金(10CD001)。
(張所濱)
黃岡師范學(xué)院學(xué)報(bào)2011年6期