劉海泉，沈 瀟，吳啟華，潘迎捷，孫曉紅

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.美國(guó)緬因大學(xué)食品科學(xué)與人類營(yíng)養(yǎng)系，美國(guó) 緬因州 04469-5735）

單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌（LM）簡(jiǎn)稱單增李斯特菌，為革蘭氏陽(yáng)性、兼性厭氧、嗜冷、過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性的桿形細(xì)菌，目前李斯特菌屬有6個(gè)種，但只有單增李斯特菌（L.monocytogenes）可導(dǎo)致人類患病，為典型的胞內(nèi)寄生菌。LM廣泛存在于環(huán)境中，據(jù)WHO報(bào)道，健康人的糞便中LM攜帶率為0.6%～16%，有70%的人可短期帶菌，但感染LM后引起的李斯特菌病有高達(dá)20%～30%的致死率[1]。2002年單增李斯特菌被WHO列為僅次于大腸桿菌O157、沙門氏菌、志賀氏菌后的第四大重要的食源性致病菌[2]。

目前有各種各樣的快速方法來(lái)檢測(cè)微生物，有免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法、生物化學(xué)和酶方法、膜過(guò)濾的方法、生物傳感器以及其他方法。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)2008版本GB/T4789.30-2008[3]，一方面增加了全自動(dòng)酶聯(lián)熒光免疫分析儀篩選法和全自動(dòng)病原菌檢測(cè)系統(tǒng)篩選法，另一方面由于成熟的商業(yè)化試劑和儀器的使用，至少縮短了2 d的檢測(cè)時(shí)間。但是由于增菌時(shí)間乃需要至少2 d時(shí)間，因此有必要開發(fā)完善新的快速檢測(cè)方法。

1 生物化學(xué)和酶學(xué)方法

1.1 快速酶促反應(yīng)顯色培養(yǎng)基

目前主要應(yīng)用的有CHROMagar Listeia顯色培養(yǎng)基和3MTM PetrifilmTM測(cè)試片。張淑紅等在人工污染樣品和實(shí)際樣品檢測(cè)中，顯色培養(yǎng)基CHROMagar Listeria和HK Listeria與傳統(tǒng)平板OXA和MMA可以達(dá)到相同的檢測(cè)限和靈敏度，且具有更高的特異性，可大大提高檢測(cè)效率[4]。王殿夫比較了3MTM PetrifilmTM環(huán)境李斯特菌測(cè)試片和平板法定量檢測(cè)肉制品中的LM。結(jié)果表明，3MTM Petri－filmTM環(huán)境李斯特菌測(cè)試片法和平板法檢測(cè)LM的結(jié)果基本一致，適合于肉制品中LM的檢測(cè)[5]。

1.2 全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)

隨著儀器分析技術(shù)的進(jìn)步和計(jì)算機(jī)的廣泛應(yīng)用，微生物菌種鑒定逐漸由傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察和人工生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定發(fā)展進(jìn)入了基于儀器自動(dòng)化分析的鑒定系統(tǒng)階段。由于其操作可實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化、而且簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確率高，已成為微生物檢測(cè)發(fā)展的方向之一。現(xiàn)在已有很多全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)，如VITEK系統(tǒng)、MIDI系統(tǒng)、BIOLOG系統(tǒng)、SENSITITRE系統(tǒng)、AUTOSCEPTOR系統(tǒng)及 MICROSCAN 系統(tǒng)等[6]。

2 分子生物學(xué)方法

2.1 探針雜交

DNA探針?lè)ɡ猛凰?、生物素等?biāo)記的特定DNA片斷，當(dāng)DNA探針與待測(cè)的非標(biāo)記單鏈DNA（或RNA）按堿基順序互補(bǔ)結(jié)合時(shí)，以氫鍵將2條單鏈連接而形成標(biāo)記DNA-DNA（或標(biāo)記DNARNA）的雙鏈雜交分子。將未配對(duì)結(jié)合的核苷酸溶解后用檢測(cè)系統(tǒng)（放射自顯影或酶檢測(cè)等）檢測(cè)雜交反應(yīng)結(jié)果。因此利用該方法可以檢測(cè)樣品中是否存在LM，測(cè)定放射性或熒光強(qiáng)度可以得出樣品中LM的個(gè)數(shù)。Byron F等針對(duì)李斯特屬16S核糖體亞單元的特異序列設(shè)計(jì)了6個(gè)熒光標(biāo)記的肽核酸探針，與整個(gè)細(xì)胞進(jìn)行原位熒光雜交[7]。

2.2 PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）

PCR是近年來(lái)應(yīng)用最廣的分子生物學(xué)方法，在食源性致病菌的檢測(cè)中均是以其遺傳物質(zhì)高度保守的核酸序列設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行擴(kuò)增。張輝等針對(duì)hly基因建立的PCR方法，具有較強(qiáng)的特異性[8]。李盛豐等針對(duì)iap、prfA毒力基因，設(shè)計(jì)引物，比較了單個(gè)PCR、多重PCR、套式PCR等3種方法[9]。Yi Chen等通過(guò)設(shè)計(jì)多條引物建立了多重PCR方法，該方法能夠檢測(cè)李斯特屬細(xì)菌、LM的1/2a和4b血清型及LM的I、II和III基因型[10]。Alka Mukhopa dhyay等針對(duì)大腸桿菌0157：H7的fliCh7基因和LM的iap基因，研究了能同時(shí)檢測(cè)這兩種病原菌的多重PCR，其具有專一、快速、敏感的特點(diǎn)[11]。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是迄今為止定量最準(zhǔn)確、重現(xiàn)性最好的定量方法，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究、病原體檢測(cè)、藥物療效考核等諸多領(lǐng)域。Enrica等通過(guò)雙標(biāo)記的探針和對(duì)熔解曲線的分析建立了能同時(shí)檢測(cè)牛奶中的沙門氏桿菌、LM和大腸桿菌O157的多重實(shí)時(shí)定量PCR[12]。Justin等針對(duì)ssrA基因建立了實(shí)時(shí)定量PCR，其在食品樣品中的檢測(cè)限為（1－5）CFU/25g，利用該方法對(duì) 175件食品樣品和31件對(duì)照進(jìn)行檢測(cè)并與ISO方法比較，具有99.44%的特異性、96.15%靈敏度和99.03%準(zhǔn)確性[13]。

2.3 基因芯片

基因組研究計(jì)劃的實(shí)施，帶動(dòng)了生命科學(xué)研究的革命，基因芯片就是在多種微生物基因組序列被確定之后出現(xiàn)的一種新興檢測(cè)技術(shù)。這種技術(shù)利用從食品微生物中擴(kuò)增到的序列標(biāo)記熒光作為探針，與固定在玻片上的成千上萬(wàn)已知DNA序列（主要是細(xì)菌）進(jìn)行雜交，結(jié)果可以通過(guò)直接的熒光掃描或酶學(xué)方法進(jìn)行測(cè)定。由于在一個(gè)芯片上囊括了眾多的已知菌序列，故可以同時(shí)鑒定檢測(cè)樣品中的多種細(xì)菌。Sergeev等研制了一種能夠檢測(cè)4種弧形桿菌屬、6種李斯特菌、16種金黃色葡萄球菌腸毒素和6種產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的DNA芯片，其中LM純培養(yǎng)的檢測(cè)限為200 cfu/g[14]。

2.4 依賴核酸序列的擴(kuò)增檢測(cè)（NASBA）

該反應(yīng)依賴于禽源成髓細(xì)胞瘤逆轉(zhuǎn)錄酶（AMV-RT）、RNaseH和T7 RNA聚合酶，在3種酶的共同作用下，以單鏈RNA為模板進(jìn)行核酸序列的擴(kuò)增。Anna Nadal等發(fā)展了分子信標(biāo)實(shí)時(shí)NASBA（QNASBA）法檢測(cè)和鑒定LM，驗(yàn)證了hly基因mRNA序列與QNASBA的效率和靈敏度。該方法能檢測(cè)到100個(gè)目標(biāo)分子和LM對(duì)數(shù)期的40個(gè)細(xì)胞[15]。

3 免疫學(xué)方法

免疫學(xué)方法是基于抗體、抗原的反應(yīng)，只需少許樣品就可以精確檢出抗原，并且不易受基質(zhì)影響，提供實(shí)時(shí)信息。目前已有的檢測(cè)方法有：酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（ELISA）、酶聯(lián)熒光分析法（ELFA）、乳膠凝集、免疫傳感器、免疫擴(kuò)散及免疫色譜技術(shù)等。

Mattingly等首先于1988年報(bào)道了針對(duì)LM鞭毛抗原的單克隆抗體ELISA檢驗(yàn)程序，該法2～3 d內(nèi)可從自然污染樣品中檢出LM[16]。Kim等設(shè)計(jì)了與hly基因PCR擴(kuò)增的132 bp產(chǎn)物雜交的探針，建立的PCR-ELISA法可以在5 h內(nèi)檢測(cè)出10個(gè)LM細(xì)胞[17]。

Sewell等將 LM 培養(yǎng)增菌至（104～105）cfu/mL 后用自動(dòng)酶聯(lián)熒光免疫檢測(cè)系統(tǒng)（VIDAS）檢測(cè)。陽(yáng)性結(jié)果檢出率為97%，假陰性、假陽(yáng)性結(jié)果檢出率為1.9%、3.0%[18]。林濤等采用全自動(dòng)熒光酶免疫分析儀（mini VIDAS）和國(guó)標(biāo)法相結(jié)合，能在48 h內(nèi)對(duì)樣品進(jìn)行快速篩選[19]。

免疫磁性分離技術(shù)是在磁性顆粒表面偶聯(lián)特異性抗體，抗體與樣品中被檢致病菌發(fā)生特異性的結(jié)合，在外加磁場(chǎng)的作用下載有致病菌的磁性顆粒向磁極方向聚集，棄掉樣品混合液，從而使致病菌不斷分離、濃縮。Yang等利用羧基優(yōu)化改良的納米磁珠與兔抗LM抗體共價(jià)結(jié)合，通過(guò)胺基在人為污染的牛奶中有效捕捉目標(biāo)，并與實(shí)時(shí)PCR結(jié)合，可以檢測(cè)到0.5 mL牛奶或營(yíng)養(yǎng)肉湯樣本中102個(gè)細(xì)胞[20]。

4 生物傳感器檢測(cè)

生物傳感器技術(shù)近20 a來(lái)有了迅猛的發(fā)展，它能滿足食品中對(duì)病原微生物靈敏、實(shí)時(shí)檢測(cè)的要求。Pratik Banerjee等首次使用基于膠原質(zhì)封裝哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞傳感器快速檢測(cè)病原菌或毒素。把B-雜交瘤細(xì)胞、Ped-2E9細(xì)胞封裝在I型膠原基質(zhì)構(gòu)成的多板生物傳感器，快速檢測(cè)致病性李斯特菌活細(xì)胞、李斯特溶血素O和蘇云芽孢桿菌腸毒素[21]。

5 討論

食品中病原菌檢測(cè)的主要問(wèn)題之一是時(shí)間。目前出現(xiàn)了許多鑒定各種病原菌的快速方法，如PCR技術(shù)、基因探針、酶聯(lián)免疫方法等，但大部分還是處于實(shí)驗(yàn)室階段。通?？焖勹b定方法是在增菌之后、生化鑒定培養(yǎng)之前進(jìn)行。這些檢測(cè)方法適用于對(duì)某種陰性結(jié)果進(jìn)行快速評(píng)價(jià)。但是在可能性非常低的情況下，某些死細(xì)胞會(huì)與免疫球蛋白結(jié)合，或者死細(xì)胞的DNA被擴(kuò)增，使檢測(cè)結(jié)果成假陽(yáng)性。這也是目前PCR方法和免疫學(xué)方法需要解決的問(wèn)題。因此，當(dāng)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，對(duì)培養(yǎng)物一定要慎重處理，應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)來(lái)確認(rèn)。另外，各種快速檢測(cè)方法受到前處理的制約，前處理是目前的瓶頸。做好樣品的前處理，就能夠在實(shí)際食品樣品中排除干擾，避免錯(cuò)誤結(jié)果。因此，只有解決好樣品的前處理，快速檢測(cè)方法才有可能應(yīng)用到實(shí)踐。

由于LM分布廣，適應(yīng)能力強(qiáng)，對(duì)人類健康威脅大，因此簡(jiǎn)單快速、靈敏高效、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、自動(dòng)化程度高的檢測(cè)技術(shù)顯得非常重要。但是目前還沒(méi)有一種方法可以同時(shí)兼?zhèn)湟陨蟽?yōu)點(diǎn)。由于LM的單克隆抗體制備較困難，具有種特異的抗體一直是免疫學(xué)方法要解決的問(wèn)題。樣品中由于存在死的致病菌、特異性DNA片段，常常造成PCR檢測(cè)結(jié)果比常規(guī)方法假陽(yáng)性率增大，陽(yáng)性率變高。

此外，從GB/T4789.30的08版與03版變化可以看出，新技術(shù)和新材料的使用，使得檢測(cè)時(shí)間大為減少，但仍以“金標(biāo)準(zhǔn)”的常規(guī)培養(yǎng)為主。雖然目前的快速檢測(cè)手段還有很多問(wèn)題需要解決，但隨著新技術(shù)和新材料的出現(xiàn)，以及理論研究的深入，一些技術(shù)必將在食源性致病微生物檢測(cè)和鑒定方面替代經(jīng)典方法。檢測(cè)手段固然重要，但是不能因此忽略預(yù)防的重要性。執(zhí)行良好的操作規(guī)范（GMP）和良好衛(wèi)生規(guī)范（GHP），并用HACCP體系管理食品的生產(chǎn)和加工，從源頭上杜絕LM污染，才是避免LM危害的首選。

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