廖 萱，蘭長駿

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科，四川 南充 637000)

白內(nèi)障的發(fā)生是一個復(fù)雜的過程，大量的實驗和臨床研究提示氧化應(yīng)激與白內(nèi)障有密切關(guān)系。氧化還原系統(tǒng)失衡導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧自由基生成增加和細(xì)胞膜功能障礙，引起晶狀體纖維蛋白的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象改變，導(dǎo)致晶狀體混濁。研究顯示:在各種氧化應(yīng)激損傷過程中，細(xì)胞內(nèi)氧化還原調(diào)節(jié)的關(guān)鍵是蛋白質(zhì)巰基(-SH)被氧化形成二硫鍵(-S-S-)，導(dǎo)致蛋白二硫化物的形成。目前已知的細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)二硫化物還原的系統(tǒng)主要是巰基-二硫鍵還原酶家族，巰基轉(zhuǎn)移酶(thioltransferase，TTase)是這個家族的重要組分［1］。近年來對TTase系統(tǒng)的研究日益受到重視，對細(xì)胞氧化還原機(jī)制的認(rèn)識也進(jìn)一步加深。研究表明，TTase對還原蛋白二硫化物的二硫鍵具有高度的特異性，是機(jī)體中催化蛋白二硫化物還原唯一的酶［2］。TTase可在其活性位點和對應(yīng)二硫化物的半胱氨酸殘基完成可逆的巰基-二硫鍵交換反應(yīng)，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)巰基或二硫鍵發(fā)生氧化還原所致的蛋白分子構(gòu)型改變，從而阻抗蛋白質(zhì)的氧化應(yīng)激損傷或恢復(fù)受損蛋白質(zhì)的生物活性［3］。TTase通過細(xì)胞內(nèi)氧化還原的調(diào)節(jié)，在體內(nèi)氧化防御體系中發(fā)揮著重要作用，并由此衍生出諸多細(xì)胞內(nèi)外功能。

1 概況

1.1 分布:巰基轉(zhuǎn)移酶又稱為谷氧還蛋白，廣泛存在于原核、真核生物中，一般含有100個左右氨基酸殘基，由Askelof等［4］1974年在大鼠肝組織首次發(fā)現(xiàn)，并指出此酶催化巰基-二硫鍵交換。1976年Holmgren等［5］在缺失 Trx基因的大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)TTase利用輔酶Ⅱ(NADPH)傳遞的電子還原靶蛋白中的二硫鍵，參與DNA合成。目前學(xué)者們已在大部分的生物體中發(fā)現(xiàn)TTase，并得到深入廣泛的研究。

對于眼組織中 TTase的研究由 Raghavachari［6］等首次報導(dǎo)，指出TTase主要集中于晶狀體，分子量為11.5kDa，在大鼠、豬、牛、豚鼠、雞胚胎和人類的晶狀體中功能和結(jié)構(gòu)相似;TTase在晶狀體上皮細(xì)胞中分布均勻且含量較皮質(zhì)和核更高，其活性有賴于谷胱甘肽(Glutathione，GSH)、谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase，GR)和 NADPH，在 30℃、PH 7.4的磷酸鹽緩沖液中表現(xiàn)出最大活性。隨后在1997年克隆了來源于人晶狀體的 TTase cDNA［7］。Wu［8］證實在大多數(shù)眼組織中發(fā)現(xiàn)TTase，其在眼組織的分布主要集中在眼前節(jié)，在晶狀體上皮細(xì)胞中的活性遠(yuǎn)大于晶狀體皮質(zhì)和核，玻璃體中沒有檢測到具有活性的TTase。人晶狀體TTase可以高效還原蛋白二硫化物混合物和具有脫氫抗壞血酸還原酶活性，其結(jié)構(gòu)和功能特性與豬肝臟和人胎盤TTase完全相同［9］。

1.2 結(jié)構(gòu)和分類:TTase蛋白具有3個活性區(qū)域，即暴露于蛋白表面的巰基-二硫鍵活性位點CXXC或CXXS，還原型谷胱甘肽(GSH)結(jié)合位點，和疏水性表面區(qū)域。TTase通常以氧化態(tài)或者還原態(tài)存在。典型的TTase有兩個半胱氨酸殘基(-Cys)，氧化態(tài)時兩個半胱氨酸殘基的巰基以分子內(nèi)部二硫鍵的形式連接，還原態(tài)時C端和N端半胱氨酸殘基的巰基形成鄰位雙巰基活性中心，提供參與蛋白質(zhì)巰基-二硫鍵轉(zhuǎn)換的側(cè)鏈基團(tuán)-SH;附近的GSH結(jié)合位點用以結(jié)合還原型GSH并共同作用于蛋白質(zhì)二硫鍵。

在不同生物體中有多種不同結(jié)構(gòu)和催化功能的TTase異構(gòu)體。根據(jù)結(jié)構(gòu)和催化特點可以大致分為四類:第一類具有典型的二巰基活性位點序列CXXC和標(biāo)準(zhǔn)的折疊結(jié)構(gòu)，是核糖核苷酸還原酶的電子供體，分子量約為10kDa。第二類具有二巰基活性位點序列CPYC(Cys22-Pro-Tyr-Cys25)，主要由含有活性位點的折疊區(qū)和α螺旋構(gòu)成，具有TTase的氧化還原酶活性。第三類具有單巰基活性位點序列CXXS，對其底物有相當(dāng)?shù)奶禺愋浴５谒念愔参顲C型，較其它物種的TTase研究少。人類的TTase有兩種同工酶，分別定位于5q14和1q31.3。

1.3 生理功能:TTase是巰基－二硫鍵氧化還原酶家族的重要組成部分，在體內(nèi)通過廣泛的途徑進(jìn)行氧化還原調(diào)節(jié)，提供細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的還原環(huán)境，抵抗氧化應(yīng)激損傷［10］。TTase可恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)一些含有半胱氨酸殘基的抗氧化蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而阻抗和治療活性氧導(dǎo)致的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷［11］。William A［12］等研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌中還原型谷胱甘肽(GSH)多于氧化型谷胱甘肽(GSSG)，GSH∶GSSG比例達(dá)50－200∶1，推測大腸桿菌內(nèi)TTase利用還原型GSH對維持巰基基團(tuán)的還原狀態(tài)起了一定的作用。在正常情況下，動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)TTase也有所表達(dá)，說明TTase在正常情況下維持細(xì)胞內(nèi)還原環(huán)境的重要作用。TTase的抗氧化作用還表現(xiàn)在細(xì)胞受到氧化應(yīng)激后其基因表達(dá)增加，通過表達(dá)上調(diào)來抵抗氧化應(yīng)激、保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。Raghavachari［13］等報導(dǎo)在氧化應(yīng)激條件下，人晶狀體上皮細(xì)胞TTase表達(dá)上調(diào)，參與晶狀體上皮細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的維持。Lofgren［14］發(fā)現(xiàn)敲除 TTase的小鼠晶狀體上皮細(xì)胞(TTase□/□)抗氧化應(yīng)激能力低于野生型(TTase+/+)，這些細(xì)胞更難存活和更多凋亡，移除H2O2的能力減弱。將純化TTase重新加載到TTase□/□細(xì)胞，細(xì)胞抗氧化功能修復(fù)至接近正常狀態(tài)。

TTase也是一種具有多種生物學(xué)功能的多效性細(xì)胞因子，參與生命活動的許多環(huán)節(jié)。通過其半胱氨酸殘基上巰基和二硫鍵的可逆轉(zhuǎn)換，可以改變某些功能性蛋白分子的構(gòu)型，調(diào)控蛋白分子的活性、穩(wěn)定性與正確折疊等，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著重要作用。TTase能與細(xì)胞凋亡的信號調(diào)控激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1)結(jié)合并抑制其活性;葡萄糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激代謝能激活A(yù)SK1-MEKMAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和使TTase從ASK1上分離;通過Ras-PI3K-Akt-NFκB途徑，使NF-κB的DNA結(jié)合能力加強(qiáng)，抑制神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺(DA)對細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷所介導(dǎo)的凋亡。TTase還對轉(zhuǎn)錄因子AP-1、NF-1、Atf1和Pap1進(jìn)行復(fù)雜調(diào)控。

2 抗氧化作用機(jī)制

機(jī)體組織或細(xì)胞受到氧化應(yīng)激損傷后，脆弱的蛋白質(zhì)巰基與非蛋白巰基配對形成二硫鍵-S-S-，形成蛋白質(zhì)-S-S-谷胱甘肽(Pr-S-S-G)，或蛋白質(zhì)-S-S-半胱氨酸(Pr-S-S-C)和蛋白質(zhì)-S-S-γ-谷氨酰半胱氨酸等形式的蛋白質(zhì)巰基二硫化物混合物。TTase利用谷胱甘肽作為輔酶，催化二硫化物的二硫鍵還原為巰基，恢復(fù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，從而對抗和修復(fù)活性氧所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷，維持體內(nèi)穩(wěn)定的氧化還原狀態(tài)。具有谷胱甘肽化作用的蛋白還包括蛋白分子伴侶、細(xì)胞骨架蛋白、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)子等。

2.1 單巰基機(jī)制:催化還原蛋白與小分子形成的混合二硫鍵，如蛋白谷胱甘肽二硫化物(Pr-S-S-G)時，TTase僅利用N端半胱氨酸的巰基［15］，即兩個還原狀態(tài)半胱氨酸的巰基中只需其中一個起作用，這一機(jī)制稱為單巰基機(jī)制。研究證明，單個的半胱氨酸即可提供還原Pr-S-S-G的二硫鍵活性。由于TTase對谷胱甘肽具有親和力，TTase并不作用于Pr-S-S-G的蛋白底物本身，而是與其谷胱甘肽部分-S-S-G特異地相互作用，形成中間物TTase-S-S-G，并釋放還原態(tài)目標(biāo)蛋白 Pr-SH。TTase-S-S-G再被第二個GSH分子還原成為谷胱甘肽二硫化物(GSSG)，谷朧甘肽還原酶(GR)利用磷酸戊糖途徑提供的NADPH為供氫體，將GSSG還原為GSH。

2.2 二巰基機(jī)制:除單巰基還原機(jī)制外，TTase催化氧化還原機(jī)制還包括二巰基還原機(jī)制。二巰基機(jī)制是對蛋白質(zhì)內(nèi)二硫鍵的還原，催化還原通常發(fā)生在TTase上的兩端半胱氨酸上，且TTase兩個還原狀態(tài)的半胱氨酸的巰基都是必需的。N端半胱氨酸暴露成為TTase活性位點攻擊蛋白分子內(nèi)二硫鍵，在TTase和蛋白底物之間形成混合二硫化物。然后另一活性位點C端半胱氨酸去質(zhì)化，攻擊N端形成分子內(nèi)二硫鍵;同時蛋白底物與TTase形成的混合二硫化物的-S-S-被還原，從而產(chǎn)生還原態(tài)目標(biāo)蛋白Pr-(SH)2，以及氧化態(tài) TTase-S2。

3 TTase與晶狀體的氧化還原

晶狀體存在多重抗氧化屏障維持著氧化還原狀態(tài)的平衡。在正常晶狀體中，絕大部分蛋白質(zhì)巰基處于還原態(tài)，以穩(wěn)定晶狀體纖維蛋白的結(jié)構(gòu)和排列，而晶狀體纖維蛋白的結(jié)構(gòu)和排列關(guān)系決定了晶狀體的透明性。由于晶狀體蛋白含較多對氧化作用敏感半胱氨酸和巰基，易于形成二硫鍵;在氧化應(yīng)激下，半胱氨酸的巰基被氧化成可逆再生的分子內(nèi)/間二硫鍵形式，晶狀體蛋白以二硫鍵相互連接形成聚合體，聚合體之間再以非共價鍵相連，從而產(chǎn)生巨大分子的高分子量蛋白(HM)，并組成水不溶性蛋白，光散射增加，蛋白結(jié)構(gòu)改變，內(nèi)在修復(fù)酶系統(tǒng)功能被破壞，晶狀體發(fā)生混濁。

研究表明，TTase對維持晶狀體巰基-二硫鍵氧化還原內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定至關(guān)重要，可能在保護(hù)晶狀體免受氧化應(yīng)激損傷方面發(fā)揮著重要作用。Raghabachari［13］等將人晶狀體上皮細(xì)胞(HLEB3)暴露于0.1mmol H2O2，觀察到TTase的活性與H2O2呈時間依賴關(guān)系，5分鐘時TTase mRNA的表達(dá)開始增加，10分鐘后達(dá)最高水平，60分鐘恢復(fù)至正常水平。兔晶狀體上皮系(N/N 1003A)較之人晶狀體上皮細(xì)胞(HLEB3)的抗氧化活性更強(qiáng)，對H2O2的耐受劑量差異達(dá)5倍［16］。但長時間暴露于更高濃度的H2O2下會導(dǎo)致TTase下調(diào)。Wang［17］等將豬晶狀體暴露在不同濃度(0.1mmol-10mmol)H2O2下培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)24小時后濃度0.1 mmol H2O2組活性下降了12%，1.5 mmolH2O2組活性下降了45%，10 mmol H2O2組幾乎不能檢測到 TTase，證實 TTase的活性與H2O2呈濃度依賴關(guān)系。Moon［18］等研究發(fā)現(xiàn)，在氧化應(yīng)激下培養(yǎng)的豬晶狀體的晶狀體上皮細(xì)胞層TTase活性、蛋白表達(dá)以及mRNA轉(zhuǎn)錄增加，輕度H2O2刺激下TTase活性呈現(xiàn)緩慢的增加，強(qiáng)H2O2刺激下酶活性快速增加，隨后穩(wěn)定下降;沒有H2O2刺激的對照組，酶活性和表達(dá)在整個實驗期維持穩(wěn)定。在氧化應(yīng)激早期表現(xiàn)為TTase表達(dá)上調(diào)，提示TTase在早期防御中的重要性，發(fā)揮著保護(hù)晶狀體蛋白和酶的重要功能;但長期處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下，超過TTase對抗氧化應(yīng)激的能力，則會損害TTase系統(tǒng)，導(dǎo)致TTase活性和含量下降。

TTase特異性地使晶狀體蛋白質(zhì)氧化形成的二硫鍵斷裂，并在其活性位點的Cys與對應(yīng)二硫化物之間進(jìn)行巰基－二硫鍵交換，從而恢復(fù)蛋白質(zhì)的自由巰基，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)巰基/二硫化物的穩(wěn)態(tài)，阻止晶狀體蛋白形成交聯(lián)。除了作為細(xì)胞內(nèi)防御系統(tǒng)對抗氧化損傷而保護(hù)晶狀體蛋白，TTase對晶狀體氧化損傷也有修復(fù)的作用。TTase可通過還原蛋白質(zhì)谷胱甘肽二硫化物等過程來調(diào)節(jié)和修復(fù)晶狀體中含巰基的蛋白質(zhì)或酶的活性，恢復(fù)其還原狀態(tài)和生理功能，保持糖代謝和提供維持細(xì)胞活力所需的能量［19］，有助于晶狀體透明性的恢復(fù)。脫氫抗壞血酸是一種存在于房水和晶狀體的氧化物，能誘導(dǎo)白內(nèi)障的形成;TTase催化脫氫抗壞血酸還原為抗壞血酸［20］，保護(hù)晶狀體。TTase可以還原在氧化應(yīng)激作用下晶狀體中某些活性降低或丟失的抗氧化酶。Lou［21］等實驗發(fā)現(xiàn)，將兔晶狀體上皮細(xì)胞暴露于0.5 mmol H2O2，5分鐘后晶狀體中重要的糖酵解酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶(G-3PD)的活性丟失至20%，加入重組人晶狀體TTase(RHLT)后，其活性增加至60%;經(jīng)胱氨酸去巰基滅活的谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)，加入RHLT 30分鐘后活性恢復(fù)至初始水平的90%。體外研究中谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的催化功能很容易通過S-半胱氨?；Щ?，通過TTase催化后活性可恢復(fù)。通過對TTase和GST的對比研究，發(fā)現(xiàn)晶狀體TTase在還原晶狀體蛋白質(zhì)巰基混合的二硫化物活性方面比GST高60%－70%，TTase和GST聯(lián)合作用于晶狀體巰基二硫化物混合物沒有累加效應(yīng)［20］。谷胱甘肽還原酶(GR)在維持晶狀體的巰基基團(tuán)也發(fā)揮了關(guān)鍵作用，其活性隨著晶狀體老化和白內(nèi)障形成降低;而TTase能有效恢復(fù)人白內(nèi)障晶狀體GR活性［22］。在氧化應(yīng)激的條件下培養(yǎng)的人和兔眼晶狀體上皮細(xì)胞，當(dāng)其他氧化防御系統(tǒng)如GPx和GR嚴(yán)重滅活時，TTase仍有顯著的抗氧化的功能。Xing［23］比較不同年齡組的正常人晶狀體發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增加TTase和TRx系統(tǒng)的活性逐漸丟失，可能導(dǎo)致老化人口患白內(nèi)障的風(fēng)險增加。

4 結(jié)束語

綜上所述，TTase在保護(hù)晶狀體蛋白質(zhì)免受氧化損傷，防止晶狀體的白內(nèi)障形成中發(fā)揮重要作用。TTase在晶狀體的表達(dá)和活性的研究對于探討白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制有重要意義，并將為白內(nèi)障的藥物預(yù)防和治療提供廣闊的前景。

［1］ Holmgren A.Antioxidant function of thioredoxin and glutaredoxin systems［J］.Antioxid Redox Signal，2000，2(4):811 － 820

［2］ Rebrin I，Kamzalov S，Sohal RS.Effects of age and caloric restriction on glutathione redox state in mice［J］.Free Radic Biol Med，2003，35(6):626 －635

［3］ Fladvad M，Bellanda M，F(xiàn)ernandes PA ，et al.Molecular Mapping of Functionalities in the Solution Structure of Reduced Grx4，a Monothiol Glutaredoxin from Escherichia coli［J］.JBiol Chem，2005，280(26):24553 －24561

［4］ Askelof P，Axelsson K，Eriksson S，et al.Mechanism of action of enzymes catalyzing thiol－ disulfide interchange.Thioltransferases rather than transhydrogenases［J］.FEBSLett，1974，38(3):263 －267

［5］ Holmgren A.Hydrogen donor system for Escherichia coli ribonucleoside diphosphate reductase dependent upon glutathione［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1976，73(7):2275－2279

［6］ Raghavachari N，Lou MF.Evidence for the presence of thioltransferase in the lens［J］.Exp Eye Res，1996，63(4):433 －44 l

［7］ Raghavachari N，Shinohara T，Kikuchi T，et al.Cloning，expression and characterization of TTase cDNA from human lens［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，1997，38(5):581

［8］ Wu F，Wang GM，RaghavachariN，Lou MF.Distribution of Thioltransferase(Glutaredoxin)in Ocular Tissues［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，1998，39(3):476 －480

［9］ Raghavachari N，Qiao F，Shinohara T，et al.Cloning，high levelexpression and characterization of human lens thioltransferase［J］.Exp Eye Res，1998，66(4):465 －475

［10］ LiM，Yang Q，Zhang L，et al.Identification of novel targets of cyanobacterial glutaredoxin［J］.Arch Biochem Biophy，2007，458(2):220－228

［11］ Bandyopadhyay S，Starke DW，Mieyal JJ，et al.Thioltransferase(glutaredoxin)reactivates the DNA-binding activity of oxidationinactivated nuclear factor I［J］.JBiol Chem，1998，273(1):392－397

［12］ William A Prinz，F(xiàn)redrik Aslund.The role of the thioredoxin and glutaredoxin pathways in reducing protein disulfide bonds in the Escherichia coli cytoplasm［J］.J Biol Chem，1997，272(25):15661－15667

［13］ Ragbavacbari N，Krysan K，Xing K，et al.Regulation of thioltransferaseexpression in human lens epithelial cells［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2001，42(5):1002 － 1008

［14］ Lofgren S，F(xiàn)ernando MR，Xing KY，et al.Effectof thioltransferase(glutaredoxin)deletionon cellular sensitivityto oxidative stressand cell proliferationin lens epithelial cellsof thioltransferase knockout mouse［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2008，49(10):4497 － 4505

［15］ Qin J，Yang Y，Velyvis A，et al.Molecular views of redox regulation:three－ dimensional structures of redox regulatory proteins and protein complexes［J］.Antioxid Redox Signal，2000，2(4):827－840

［16］ Xing K，Lou MF.Effect of H2O2 on human lens epithelialcells(B3)and the possible Mechanism for OxidativeDamage Repair by Thioltransferase［J］.Exp Eye Res，2002，74(1):113 － 122

［17］ Wang GM，Raghavachari N，Lou MF.Relationship ofprotein－glutathionemixed disulfide and thioltransferase inH2O2-induced cataract in cultured pig lens［J］.Exp Eye Res，1997，64(5):693 －700

［18］ Moon S，F(xiàn)ernando MR，Lou MF.Induction of thioltransferase and thioredoxin/thioredoxin reductase systems in cultured porcine lenses under oxidative stress［J］.InvestOphthalmol Vis Sci，2005，46(10):3783－3789

［19］ Rachdan D，Lou MF，Harding JJ.Revival of inactive glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase in human cataract lenses by reduction［J］.Exp Eye Res，2004，79(1):105 －109

［20］ Lou MF.Redox regulation in the lens［J］.Prog Retin Eye Res，2003，22(5):657 －682

［21］ Lou MF，Wang GM，Wu F，et al.Thioltransferase ispresent in the lens epithelial cells as a highly oxidativestress－resistant enzyme［J］.Exp Eye Res，1998，66(4):477 － 485

［22］ Rachdan D，Lou MF，Harding JJ.Glutathione reductase from human cataract lenses can be revived by reducing agents and by a molecular chaperone，alpha-crystalline［J］.Curr Eye Res，2005，30(10):919－925

［23］ Xing KY，Lou MF.Effect of age the thioltransferase(glutaredoxin)and thioredoxin systems in the human lens［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2010;51(12):6598 － 6604