蔡 佳,黃文祥

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院感染科 400016)

生長抑素受體(somatostatin receptor,SSTR)有5種不同的分子亞型SSTR1～5,廣泛分布于腦、胰腺、甲狀腺及胃腸等組織,各亞型受體在組織中的分布也有差異[1-2]。目前,生長抑素已廣泛應用于消化系統(tǒng)疾病(如急性胰腺炎、肝硬化門靜脈高壓、上消化道出血等)及腫瘤(如神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤和胃腸道類癌瘤等)等的治療[3-4]。胰腺腺泡細胞上的各SSTR類型分布目前還存在爭議。有研究證實,生長抑素可與胰腺腺泡細胞上的SSTR結(jié)合,直接抑制胰腺分泌和淀粉酶分泌。但是胰腺腺泡細胞上與生長抑素結(jié)合發(fā)揮抑制胰腺外分泌作用的受體是哪一種受體或亞型還不清楚。本研究初步探討SD大鼠胰腺腺泡細胞上SSTR各亞型的分布及生長抑素的功能性受體亞型?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑及配制 Trizol(Invitrogen公司)、SSTR1～5引物(Invitrogen公司合成),DNA maker 100 bp ladder(SABC公司),莫落尼鼠類白血病毒(murine moloney leukemia virus,MMLV)逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq-DNA聚合酶、PCR反應緩沖液、三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)、Rnasin(Promega公司),焦磷酸乙二脂(diethy lpyrocar bonate,DEPC,Sigma公司)。4-羥乙基哌嗪乙磺酸(2-[4-(2-hydroxyerhyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid,HEPES)緩沖液的配制(氯化鈉135 mmol/L,氯化鉀 5.0 mmol/L,氯化鈣2.0 mmol/L,氯化鎂1.2 mmol/L,葡萄糖10.0 mmol/L和、HEPES 10 mmol/L,用 Tris-HCl調(diào)至pH 為 7.4)。Ring′s液的配制由氯化鈉3.79 g、磷酸二氫鉀27.2 mg、磷酸氫二鉀182.4 mg,硫酸鎂 123.2 mg、碳酸氫鈉1.05 g、醋酸鈉 680 mg、D-glucose 495 mg、α酮戊二酸 73.05 mg、甘氨酸75.07 mg、氯化鈣72.14 mg加入500 mL三蒸水中,磁力攪拌混勻后,用 Tris-HCl調(diào) pH為7.35,高壓滅菌后 4℃保存待用。消化液采用胰蛋白酶抑制劑和Ⅳ型膠原酶配制,加入Ring′s液使其充分溶解,終濃度分別為0.5 mg/mL和0.8 mg/mL。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 胰腺腺泡細胞的分離、制備及分組 首先脫頸處死雄性SD大鼠(體質(zhì)量250 g左右),立即取出胰腺。在培養(yǎng)皿中用生理鹽水清洗數(shù)次,洗凈血液并除去系膜和脂肪組織。將胰腺用細針固定于蠟板或瓊脂板上,使組織充分展開。用眼科剪將胰腺組織剪成大小約1～2 mm3組織塊。將組織塊移入含有膠原酶和胰蛋白酶抑制劑的Ring′s緩沖液中。含有胰腺組織的緩沖液中充入95%O2,在37℃恒溫震蕩水浴箱(振蕩頻率每分鐘60次)中孵育7 min。孵育過程中用口徑約1～2 mm的已過火的玻璃吸管輕輕抽打混合。沉淀在試管底部的胰腺腺泡細胞用不含消化酶的Ring′s緩沖液離心洗滌(1000 r/min×3 min),吸除含膠原酶和破碎細胞的上清液,重復此步驟,共清洗3次。洗滌后的胰腺腺泡細胞用孔徑150 μ m的尼龍網(wǎng)過濾,過濾即得到所需的胰腺腺泡細胞。胰腺腺泡細胞的純化:(1)用血細胞計數(shù)板對沉淀的胰腺腺泡細胞計數(shù),將細胞懸液稀釋至1×107個/mL。(2)將等量的細胞懸液分裝入5個試管中,分別編號為1、2、3、4、5號管。向1、2號試管中分別加入生長抑素,其終濃度為10-7mol/L。3、4、5號試管中加入等體積的Ring′s液作為對照。(3)將裝有細胞懸液的試管放入37℃恒溫震蕩水浴箱(振蕩頻率60次/min)中孵育,整個過程向試管中充入 95%O2。1、3號試管孵育時間為 15 min,2、4號試管孵育時間為30 min,5號試管孵育時間為0 min(對照)。(4)孵育完畢后將細胞懸液轉(zhuǎn)入EP管中離心(1000 r/min×3 min),棄去上清液,得到胰腺腺泡細胞沉淀。

表1 RT-PCR法檢測胰腺腺泡細胞SSTR1～5表達水平

1.3 RT-PCR法檢測胰腺腺泡細胞SST R1～5表達 見表1。(1)94°C、3 min滅活M-M LV逆轉(zhuǎn)錄酶;(2)按表2完成PCR擴增;(3)72°C、10 min最終延伸;(4)4°C保存待檢;擴增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠中電泳,觀察結(jié)果使用Labimage圖像分析系統(tǒng)對電泳結(jié)果進行量化分析。

表2 胰腺腺泡細胞SST R 1～5的RT-PCR檢測參數(shù)

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS11.0軟件進行統(tǒng)計學數(shù)據(jù)分析,計量資料以表示,采用方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 SSTR1～5 mRNA的表達水平 結(jié)果位于390、390、415、365、250 bp處的條帶均有表達,見圖 1。5號試管胰腺腺泡細胞 SSTR1～5 mRNA表達的相對量分別為0.980±0.085;0.766±0.064;0.850±0.078;0;2.010±0.225(圖 2)。SSTR1、SSTR5 mRNA表達較高。β-actin mRNA的擴增片段為180 bp,2、4與5號試管SSTR1～5 mRNA表達的相對量間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

圖1 對照組SSTR1～5 mRNA表達

2.2 15、30 min后的SSTR1～5 mRNA的表達水平 生長抑素作用15 min后SSTR1～5 mRNA表達相對量分別為0.908±0.059;1.142±0.078;0.798±0.030;0;1.852±0.132(圖3)。生長抑素作用30 min后SSTR1～5 mRNA表達相對量分別為0.891±0.049;1.347±0.063;0.764±0.071;0;1.791±0.102(圖4)。生長抑素作用后SST R2表達較對照明顯增高(P＜0.05,n=5)(圖5)。30 min與 15 min相比,SSTR2 mRNA表達量明顯增高(P＜0.05,n=5)。

圖2 生長抑素作用15 min后SSTR1～5 mRNA表達

圖3 生長抑素作用30 min后SSTR1～5 mRNA表達

圖4 生長抑素作用后胰腺腺泡細胞上SSTR的表達

圖5 生長抑素作用于胰腺腺泡細胞不同時間后SSTR2 mRNA表達

3 討 論

生長抑素及其類似物可通過與細胞膜上SSTR結(jié)合而發(fā)揮作用,根據(jù)生長抑素的這一特性,可以利用生長抑素靶向結(jié)合SSTR來診斷和治療疾病,靶向治療高效低毒。因此,近年來SSTR在各種疾病中的表達及生長抑素在該疾病中所起作用的研究日益受到重視。關于大鼠胰腺腺泡細胞上SSTR的具體類型及腺泡細胞上與生長抑素結(jié)合的特異性受體亞型,目前文獻報道較少,同時也存在一定爭議。

生長抑素的生理功能由細胞膜上的SSTR介導,SSTR是一種具有 7個跨膜區(qū)段的糖蛋白。自1992年 SSTR1和SSTR2被克隆成功至今,已確認SSTR有5種不同的分子亞型SSTR1～5[5]。有研究顯示,在人和嚙齒動物中各型SSTR mRNA以不同水平廣泛表達,各型受體的表達模式不同但又有交叉,并且存在種屬差異。本研究結(jié)果表明,在SD大鼠胰腺腺泡細胞上確實有SSTR mRNA表達,5個亞型中SSTR1～3、5均有表達,而 SST R4未見表達。有表達的 4個亞型中SSTR5 mRNA表達量明顯高于其他3個亞型。而 Hunyady等[6]認為,大鼠胰腺上的生長抑素受體為SSTR2A,而另研究認為,胰腺腺泡細胞上沒有SST R2表達[7]。該研究與本實驗研究結(jié)果存在一定差異,可能與研究動物的種屬及實驗對象不同有關。

有文獻報道,生長抑素通過SSTR1介導抑制胰腺細胞增生[8]。而Bell和 Reisine[9]從電生理實驗中觀察到 SST R2通過抑制型G蛋白亞單位α 3(Giα 3)與電壓依賴性K+通道耦聯(lián),并對K+通道起調(diào)控作用:受體興奮使K+通道開放,膜超極化抑制電壓依賴性鈣離子通道開放,細胞內(nèi)的鈣離子濃度下降,鈣離子作為第2信使進一步調(diào)節(jié)細胞內(nèi)蛋白磷酸化過程。有文獻報道,SSTR2能介導抑制環(huán)化酶(adenylate cyclase,AC)活性效應,認為是通過SSTR2B介導,因為SST R2B能通過與其耦聯(lián)的Giα 1與AC結(jié)合,并認為SSTR2的主要作用是抑制生長激素和胰島素釋放,參與中樞整合作用。Strowski等[10]利用廣泛表達SSTR的小鼠和SSTR2基因敲除的小鼠來研究介導生長抑素抑制胰島素和胰高血糖素分泌的受體亞型,結(jié)果進一步證明,生長抑素抑制胰高血糖素分泌主要通過SSTR2介導的,而胰島素的分泌主要通過SSTR5調(diào)節(jié)。Tirone等[11]也認為,是通過小鼠胰腺beta細胞上的SSTR5調(diào)節(jié)胰島素分泌。其他一些研究也證實,SSTR2在生長抑素抑制膽汁分泌和促進膽汁吸收來調(diào)節(jié)膽管內(nèi)膽汁形成[12-13]、抑制胃酸、抑制壁細胞分泌及抑制胰腺癌生長中起重要作用[14-15]。因此,SSTR2被認為是與生長抑素生物學活性密切相關的受體。

本研究利用RT-PCR檢測生長抑素作用0、15、30 min后的SSTR mRNA表達量的變化,試圖找到生長抑素具體作用的受體亞型。結(jié)果表明,SSTR2 mRNA表達量隨時間有上升趨勢,其差異有統(tǒng)計學意義。而其余的 SSTR1、SSTR3、SSTR5 mRNA表達量的改變差異無統(tǒng)計學意義。生長抑素與胰腺腺泡細胞作用后,SSTR2 mRNA表達隨作用時間而逐漸上調(diào),推測生長抑素通過與胰腺腺泡細胞上的SSTR2結(jié)合發(fā)揮其抑制胰酶合成和分泌作用,SST R2可能是胰腺腺泡細胞上與生長抑素有高度親和力的功能受體。

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