龔少愚,周春剛,高 楓,陸 曙,朱紅俊

(南京中醫(yī)藥大學(xué)無(wú)錫附屬醫(yī)院/無(wú)錫市中醫(yī)醫(yī)院心內(nèi)科,江蘇 無(wú)錫 214001)

近年來(lái)的研究表明,內(nèi)皮素(ET-1)是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)烈的收縮血管物質(zhì),內(nèi)皮素系統(tǒng)在心力衰竭(簡(jiǎn)稱(chēng)心衰)的發(fā)病過(guò)程中起著重要作用[1]。升高的血漿ET-1濃度不但和心衰時(shí)的癥狀和血流動(dòng)力學(xué)的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[2],而且影響患者的預(yù)后,能引起心肌肥厚和心肌細(xì)胞損傷[3]。ET和ET受體的生物學(xué)意義及表達(dá)調(diào)控機(jī)制日益引起人們的重視。本院利用已構(gòu)建的外周血ETA、ETB基因的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)檢測(cè)方法,對(duì)48例心衰患者和25例健康對(duì)照組的外周血中內(nèi)皮素受體基因(ETA、ETB)的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè),從而探討其臨床意義,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 心衰患者48例,均為本院心內(nèi)科2009年2月至2010年2月的住院患者,男25例,女23例,年齡49～82歲,平均(72.2±8.3)歲;其中冠心病 28例,高血壓性心臟病15例,擴(kuò)張型心肌病5例;均經(jīng)超聲心動(dòng)圖證實(shí)為充血性心力衰竭,EF值小于50%。依據(jù)NYHA心功能分級(jí),Ⅱ級(jí)13例,Ⅲ級(jí)18例,Ⅳ級(jí)17例。選擇25例健康體檢無(wú)心功能不全證據(jù)的成年人作為對(duì)照組,其中男 14例,女 11例,年齡 48～76歲,平均(68.2±7.6)歲,兩組在年齡、性別上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 方法

1.2.1 ET-1的測(cè)定 兩組均于入院后第1天清晨采空腹靜脈血 2 mL(30 μ L EDTA 加 20 μ L 抑肽酶),立即離心,分離血清,-80℃冰箱保存,集中采用放射免疫方法測(cè)定,試劑盒由北京東亞免疫技術(shù)研究所提供。

1.2.2 全血總RNA抽提 清晨采空腹靜脈血3 mL,經(jīng)EDTA?Na2抗凝,采用3S柱離心式血液總 RNA抽提試劑盒(K3620上海博彩生物科技有限公司),RNA濃度測(cè)定采用BIO-RAD核酸蛋白測(cè)量?jī)x(SmartSpec Plus Spectrophotometer),RNA提取物-80℃保存。

1.2.3 外周血 ETA、ETB基因表達(dá)的檢測(cè)方法 外周血ETA、ETB mRNA表達(dá)水平通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)。ETA受體基因引物序列,GenBank:NM-001957 正向 5′-GCT TCC TGG TTA CCA CTC ATC AA-3′,反向 5′-TAG TCT GCT GTG GGC AAT AGT TG-3′。 ETB受體基因引物序列,GenBank:NM-001101正向,5′-GCC AAG GAC CCA TCG AGA T-3′,反向 5′-GAA GTG TGG AGT TCC CGA TGA T-3′。管家基因 GAPDH作為內(nèi)參基因,GAPDH基因引物序列,GenBank:NM-002046.3,正向5′-ACA GTC AGC CGC A TC TTC TT-3′,反向 5′-ACG ACC AAA TCC GT T GAC TC-3′。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用兩步法,全血總RNA合成cDNA使用TAKARA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒(DRR037S大連寶生物工程有限公司)。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR采用SYBR PrimeScript RT-PCR KitⅡ試劑盒(DRR083S大連寶生物工程有限公司),PCR儀采用LightCycler480擴(kuò)增儀。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μ L,包括 2×SYBR Premix Ex Taq,1～ 100 ng cDNA,50 pmoL/μ L引物。兩步法 PCR循環(huán)條件:預(yù)變性95℃30 s一個(gè)循環(huán),變性 95℃5 s,退火/延伸60℃20 s,共40個(gè)循環(huán)。溶解曲線分析采用LightCycler Relative Quantification(Version 1.5)軟件,用于產(chǎn)物的特異性分析,2%瓊脂糖凝膠電泳亦用于擴(kuò)增產(chǎn)物的大小及特異性鑒定。

表1 心衰患者和健康對(duì)照組血漿ET-1水平、ETA 、ETB基因表達(dá)的比較()

表1 心衰患者和健康對(duì)照組血漿ET-1水平、ETA 、ETB基因表達(dá)的比較()

*:P＞0.05,**:P＜0.01,***:P＜0.05,與健康對(duì)照組比較。

組別 n ET-1(ng/L) ET A ET B健康對(duì)照組 25 67.34±14.36 1.08±0.32 1.00±0.28心功能Ⅱ級(jí)組 13 82.24±12.48* 1.09±0.25* 0.92±0.30*心功能Ⅲ級(jí)+Ⅳ級(jí)組 35 126.25±16.51** 2.06±0.49** 1.67±0.47***

相對(duì)定量分析采用△△CT法進(jìn)行相對(duì)定量?！鳌鰿T法是通過(guò)LightCycler Relative Quantification(Version 1.5)軟件,假定目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增效率相同時(shí),擴(kuò)增效率默認(rèn)為2,標(biāo)準(zhǔn)化比值計(jì)算公式為2-△△CT。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn),計(jì)量資料以表示,組間均數(shù)比較用方差分析,同組治療前后均數(shù)用配對(duì)t檢驗(yàn)。各檢測(cè)指標(biāo)間進(jìn)行相關(guān)性分析。所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳及溶解曲線分析 ETA、ETB和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的RT-qPCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物均為單一條帶,無(wú)引物二聚體形成,大小分別為84、99、94 bp,見(jiàn)圖 1。擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線分析,產(chǎn)物具有單一明顯而尖峭的峰圖,說(shuō)明產(chǎn)物特異無(wú)非特異性產(chǎn)物生成,見(jiàn)圖2。

圖1 目的基因和內(nèi)參基因2%瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 目的基因和內(nèi)參基因溶解曲線峰圖

2.2 心衰患者和健康對(duì)照組血漿ET-1水平、ETA、ETB基因表達(dá)的比較 結(jié)果表明,心功能Ⅱ級(jí)組的血漿ET-1水平及ETA、ETB基因表達(dá)與健康對(duì)照組比較,兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。心功能Ⅲ級(jí)+Ⅳ級(jí)組的血漿ET-1水平與健康對(duì)照組比較,兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.014,P＜0.01)。心功能Ⅲ級(jí)+Ⅳ級(jí)組的ETA基因表達(dá)與健康對(duì)照組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.317,P＜0.01);心功能Ⅲ級(jí)+Ⅳ級(jí)組的ETB基因表達(dá)與健康對(duì)照組比較,兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.235,P＜0.05)。此外,不同病因引起的心力衰竭之間血漿ET-1水平、ETA 、ETB基因表達(dá)等無(wú)顯著性差異,可能與病例數(shù)較少有關(guān),見(jiàn)表 1。

3 討 論

ET是由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一種血管收縮肽,缺氧、機(jī)械性應(yīng)力、神經(jīng)內(nèi)分泌激素(如去甲腎上腺素、血管緊張素Ⅱ)、細(xì)胞因子(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β和白介素 1β)等[4]可以刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放ET-1。大量試驗(yàn)表明在心衰過(guò)程中ET-1的水平顯著升高,它們的升高與心搏出量的減少、肺動(dòng)脈高壓、肺血管阻力的增高以及心臟的重構(gòu)、肥厚和纖維化都有關(guān)[1-5]。心衰患者中,隨著心功能的惡化,內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能呈減退趨勢(shì)[6]。ET的生物學(xué)效應(yīng)就是由內(nèi)皮特異受體介導(dǎo)的[7]。ET的受體有ETA和ETB兩種亞型[8]。ETA受體存在于血管平滑肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞中,調(diào)節(jié)血管收縮和細(xì)胞增生[9]。ETB受體存在于內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞,通常調(diào)節(jié)血管舒張;但在某些病理情況下,亦可引起血管收縮[10-11]。心衰時(shí)ETB還參與心肌纖維化的進(jìn)展和循環(huán)中ET-1的清除[12]。發(fā)生心衰時(shí)內(nèi)皮素受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)被顯著激活,表現(xiàn)為ET受體的密度上調(diào)、ET-1結(jié)合位點(diǎn)增加、血漿ET-1水平隨著心衰程度的加重而進(jìn)行性升高[13-14]。

在心衰患者中,肺循環(huán)是ET-1的主要來(lái)源和清除部位,故肺血管阻力與循環(huán)ET-1水平直接相關(guān)[11]。本文結(jié)果顯示,心衰患者血漿ET-1濃度明顯升高,與NYHA心功能分級(jí)呈正相關(guān)。Lepailleur-endouf等[15]也發(fā)現(xiàn),心衰患者失代償期血漿ET-1分別是代償期及對(duì)照組的4.2倍及6.9倍,本研究結(jié)果與其相似。本文結(jié)果還顯示,心衰患者血漿ET受體基因表達(dá)與NYHA心功能分級(jí)和血液動(dòng)力學(xué)有很大關(guān)系,心功能Ⅲ～Ⅳ級(jí)組患者ETA、ETB的基因表達(dá)水平明顯高于心功能Ⅱ級(jí)組及健康對(duì)照組,即心功能愈差,ET受體基因表達(dá)升高愈顯著。本研究中可看出,心衰患者血漿ET升高,外周血單個(gè)核細(xì)胞ETA、ETB表達(dá)上調(diào),說(shuō)明ET系統(tǒng)在心衰的促發(fā)及惡化方面起一定的作用。

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