林 虎,李慶勇,蔣知新,張鋆歆,彭 凌,杜 平,張清華△,高 毅

(1.解放軍第三〇五醫(yī)院老年病中心,北京 100017;2.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院肝膽二科,廣州 510262)

大量功能好的肝細(xì)胞是生物人工肝支持系統(tǒng)(bioartificial liver support system,BALSS)的核心[1],所以探索出一種可靠的肝細(xì)胞低溫保存方法,建立一個(gè)肝細(xì)胞庫(kù)是BALSS推廣的基礎(chǔ)[2]。UW液(University of wisconsin solution)、CS液(Celsior solution)和 HTK液(Histidine-tryptophan-ketoglutarate solution)是目前較常用的供肝保存液,但供肝的保存混雜有缺血再灌注損傷的影響,不能完全反應(yīng)對(duì)肝細(xì)胞的保存效果[3]。C3A細(xì)胞是一種人源性高分化肝腫瘤細(xì)胞,具備氨基清除和清蛋白分泌等功能,以C3A細(xì)胞為生物材料的體外肝輔助裝置(extracorporeal liver-assist device,ELAD)系統(tǒng)已經(jīng)進(jìn)入了Ⅲ期臨床試驗(yàn)[4]。但C3A細(xì)胞分別于 UW液、CS液、HTK液低溫保存后細(xì)胞存活率及功能有無差異,是否滿足BLASS的需要未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。因此,本研究分別采用UW液、CS液和HTK液于4℃常規(guī)低溫保存生物人工肝用C3A細(xì)胞72 h,以比較其保存效果。

1 材料與方法

1.1 材料 C3A細(xì)胞(ATCC,美國(guó));DM EM/F-12培養(yǎng)基、優(yōu)級(jí)胎牛血清(FBS)、青霉素/鏈霉素溶液(×100)、0.25%胰酶及PBS緩沖液(Invitrogen,美國(guó));UW 液(Bristol-myers quibb);50 mL培養(yǎng)瓶、6孔培養(yǎng)板(Costar Corning);氯化銨(Sigma);人清蛋白ELISA試劑盒(R&D,美國(guó)),Mode1450型酶標(biāo)儀(Bio-Rad,美國(guó));CK2型倒置顯微鏡(Olympus,日本);Live/Dead試劑盒(Invitrogen,美國(guó));乳酸測(cè)定試劑盒(Boehringer Mannhein),Du530型分光光度儀(Beckman,德國(guó));DXC800型全自動(dòng)生化儀及FACScan型流式細(xì)胞儀(Beckman coulter,美國(guó));MIR-151型微電腦程控低溫培養(yǎng)箱-10.1～60.1℃及MCO-175型二氧化碳培養(yǎng)箱(SANYO,日本);海爾智能溫度記錄儀-100.1～120.1℃。超凈工作臺(tái)(北京昌平長(zhǎng)城空氣凈化工程公司)。

1.2 分組 C3A細(xì)胞懸液分3組(n=8):UW液保存組(UW液組)、Celsior液保存組(CS液組)、HTK 液保存組(HTK 液組)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 取C3A細(xì)胞約 1×106個(gè),接種到50 mL培養(yǎng)瓶,所用培養(yǎng)基為DM EM/F-12加10%FBS及1%青霉素/鏈霉素溶液;將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO2、100%濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng);每24 h換液1次,倒置顯微鏡觀察直至內(nèi)壁長(zhǎng)滿。

1.4 低溫保存及復(fù)溫 傾去培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基,PBS液洗滌3次后分別置換為5 mL UW液、CS液和HTK液,于4℃保存72 h后,將保存液液置換為培養(yǎng)基5 mL,培養(yǎng)30 min。

1.5 復(fù)溫后指標(biāo)測(cè)定 取一瓶細(xì)胞,吸出培養(yǎng)基,0.25%胰酶消化,制備成濃度約1×106/mL細(xì)胞懸液。(1)取細(xì)胞懸液1 mL,加到1 mL含4 mmol/L氯化銨培養(yǎng)液的6孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后,取上清,1000 r/min離心20 min,測(cè)定尿素的濃度、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)濃度、人清蛋白含量(按人清蛋白ELISA試劑盒說明)。(2)取細(xì)胞懸液 1 mL,按照三磷酸腺苷(ATP)試劑盒的說明,于全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ATP含量。(3)剩余的細(xì)胞懸液于1000 r/min離心2 min,沉淀細(xì)胞按Live/Dead試劑盒說明,于流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞存活率、死亡率。

2 結(jié) 果

2.1 不同組低溫保存72 h后細(xì)胞存活率、死亡率 新鮮細(xì)胞的存活率是(94.96±2.16)%,死亡率是(5.04±2.16)%。低溫保存72 h后,細(xì)胞存活率較新鮮細(xì)胞降低,UW液組細(xì)胞存活率顯著高于HTK液組(P＜0.001),同CS組無差異;細(xì)胞死亡率較新鮮細(xì)胞增加,UW液組細(xì)胞死亡率顯著低于HTK液組(P＜0.001),但同 CS液組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表 1、圖1～4。

表1 不同組低溫保存72 h后細(xì)胞存活率和死亡率(,%)

表1 不同組低溫保存72 h后細(xì)胞存活率和死亡率(,%)

*:P＜0.05,與同時(shí)間點(diǎn)UW液組比較;#:P＜0.05,與同時(shí)間點(diǎn)CS液組比較。

組別 細(xì)胞存活率 細(xì)胞死亡率UW液組 78.56±4.67 21.44±4.67 CS液組 76.03±3.53 23.97±3.53 HTK液組 60.54±3.18*# 39.46±3.18*#

圖1 新鮮細(xì)胞流式圖

低溫保存72 h后流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞存活率和死亡率。Calcein AM/Ethidium homodimer-1雙染,Calcein AM可將存活細(xì)胞染成綠色,Ethidium homodimer-1可與死亡細(xì)胞核結(jié)合,呈紅色。流式細(xì)胞儀分析,獲得4個(gè)象限的直方圖和峰狀圖。直方圖B4:Calcein AM+表示正常細(xì)胞;B1:Ethidium homodimer-1+表示死亡細(xì)胞;B2與B3:(An-PI+)表示操作過程中損傷的細(xì)胞。峰狀圖:Ethidium homodimer-1陰性和陽(yáng)性百分比(細(xì)胞存活率和死亡率)。

圖2 UW液組流式圖

圖3 CS液組流式圖

圖4 HTK液組流式圖

2.2 不同組低溫保存72 h后細(xì)胞ALT與乳酸釋放 新鮮細(xì)胞釋放的ALT是(3.45±0.66)U/L,乳酸釋放是(2.55±1.04)μ g/106cells。低溫保存72 h后,細(xì)胞ALT釋放及乳酸釋放較新鮮細(xì)胞增加,但UW 液組、CS液組乳酸脫氫酶(LDH)釋放及乳酸釋放均顯著低于HTK液組(P＜0.01),UW液組同CS液組ALT釋放(P=0.459)及乳酸釋放(P=0.935)無差異。見表2。

表2 不同組低溫保存72 h后細(xì)胞ALT與乳酸釋放()

表2 不同組低溫保存72 h后細(xì)胞ALT與乳酸釋放()

*:P＜0.05,與同時(shí)間點(diǎn)UW 液組比較;#:P＜0.05,與同時(shí)間點(diǎn)CS液組比較。

組別 A LT釋放(U/L) 乳酸釋放(μ g/106cells)UW 液組 5.73±1.09 10.48±1.13 CS液組 6.08±0.78 10.39±1.85 HTK液組 8.25±1.12*# 17.89±3.54*#

表3 不同組低溫保存72 h后細(xì)胞尿素合成與清蛋白分泌()

表3 不同組低溫保存72 h后細(xì)胞尿素合成與清蛋白分泌()

*:P＜0.05,與同時(shí)間點(diǎn)UW 液組比較;#:P＜0.05,與同時(shí)間點(diǎn)CS液組比較。

分組 尿素合成(mmol/L) 清蛋白分泌(g/L)UW 液組 0.52±0.11 1.79±0.26 CS液組 0.51±0.06 1.75±0.21 HTK液組 0.32±0.05*# 1.20±0.17*#

2.3 不同組低溫保存72 h后細(xì)胞尿素合成功能及清蛋白分泌功能 新鮮細(xì)胞尿素合成是(0.99±0.20)mmol/L,清蛋白分泌是(2.23±0.33)g/L。低溫保存72 h后,細(xì)胞尿素合成功能下降,但 UW液組尿素合成功能優(yōu)于 HTK液組(P=0.002),同CS液組無差別(P=0.917);細(xì)胞清蛋白分泌功能下降,但UW液組清蛋白分泌優(yōu)于HTK液組(P＜0.01),同CS液組無差異(P=0.724)。見表3。

3 討 論

BALSS要代替肝臟,除細(xì)胞材料必須具有肝臟特異性功能外,還需要大量肝細(xì)胞,即約109個(gè)數(shù)量級(jí)才有臨床意義。為了滿足臨床對(duì)肝細(xì)胞數(shù)量的需求,傳統(tǒng)上采取傳代培養(yǎng)或者微載體高密度培養(yǎng)的方法,但其工作量大、易污染、費(fèi)用高且肝細(xì)胞經(jīng)多次傳代后活性下降。所以探索一種可靠的肝細(xì)胞低溫保存方法,建立一個(gè)肝細(xì)胞庫(kù)以克服肝細(xì)胞多次傳代培養(yǎng)的缺點(diǎn),是短期內(nèi)獲得大量肝細(xì)胞的較好方法[5]。本文分別采用UW液、CS液和HTK液4℃常規(guī)低溫保存生物人工肝用C3A細(xì)胞72 h,使用流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)UW液組細(xì)胞存活率顯著高于HTK液組,細(xì)胞死亡率則相反;同時(shí)發(fā)現(xiàn)UW液組的反應(yīng)細(xì)胞損傷程度的ALT釋放及反應(yīng)低溫代謝水平的乳酸釋放顯著低于HTK液組;UW液組的肝細(xì)胞尿素合成功能和清蛋白分泌功能優(yōu)于HTK液組,但同CS液組相比無差別,具體可能的原因分析如下。

3.1 從滲透壓成分分析UW液中添加了羥乙基淀粉、密三糖和乳糖醛酸等非滲透性保護(hù)劑,而CS液和HTK液以甘露醇為非滲透性保護(hù)劑,另外Celsior液含有乳糖醛酸。羥乙基淀粉、低分子右旋糖酐和甘露醇等是比較常用的非滲透性保護(hù)劑,具體保護(hù)機(jī)制目前仍然不明確,可能是與凍存過程中減少細(xì)胞內(nèi)冰晶形成及復(fù)蘇時(shí)減輕由于滲透壓改變引起的細(xì)胞腫脹有關(guān)。另外大量的研究顯示低溫保存液中添加膜穩(wěn)定劑糖類物質(zhì)可提高復(fù)溫后肝細(xì)胞存活率:(1)Miyamoto等[6]發(fā)現(xiàn)在凍存介質(zhì)中添加葡萄糖(單糖)、海藻糖(雙糖)、麥芽糖(三糖)或者長(zhǎng)鏈糖均可明顯提高復(fù)溫后肝細(xì)胞的存活率,減輕肝細(xì)胞凍存損傷。(2)海藻糖是一種雙糖,Katenz等[7]在10%二甲基亞砜(DMSO)基礎(chǔ)上添加不同濃度的海藻糖-156℃凍存原代人肝細(xì)胞7 d。結(jié)果顯示,同單用10%DMSO相比,添加海藻糖可以明顯提高復(fù)蘇后肝細(xì)胞存活率[(62.9±13)%,(46.9±11)%,P＜0.01],更好的維持清蛋白分泌、尿素合成能力及Ⅰ相、Ⅱ相細(xì)胞代謝能力,降低LDH、AST釋放;海藻糖的最合適濃度是0.2 mmol/L。(3)Limaye和 Kale[8]在 10%DMSO基礎(chǔ)上分別添加海藻糖和抗氧化劑過氧化氫酶于-80℃或者-196℃凍存人胎肝細(xì)胞發(fā)現(xiàn),海藻糖和過氧化氫酶均明顯提高了凍存復(fù)蘇后肝細(xì)胞的存活率及生物轉(zhuǎn)化功能,而且兩者于-196℃可產(chǎn)生協(xié)同作用,-80℃未觀察到協(xié)同效應(yīng)。綜上,UW液中聯(lián)合應(yīng)用羥乙基淀粉、密三糖和乳糖醛酸等非滲透性保護(hù)劑及同CS液和HTK液相比,可能更適合肝細(xì)胞的低溫保存。

3.2 從緩沖系統(tǒng)分析UW液以磷酸鹽為緩沖系統(tǒng)防止細(xì)胞酸中毒,UW液的pH值為7.4;而HTK液則加入了強(qiáng)有力的酸堿緩沖系統(tǒng)-組氨酸緩沖系統(tǒng),其中CS液的組氨酸含量較低同時(shí)含有OH-以防止細(xì)胞內(nèi)酸中毒,CS液和HTK液的pH值分別為7.3、7.2。盡管組氨酸有強(qiáng)大的緩沖能力,可以有效地減輕H+的聚集,解除糖酵解的抑制,使ATP和乳酸有較大的生成率,但Bahde等[9]發(fā)現(xiàn)使用HTK液低溫保存鼠肝,復(fù)溫后因大量氧自由基產(chǎn)生,可引起大量肝細(xì)胞凋亡。而組氨酸則增加肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生,通過減少組氨酸含量,使用N-乙酰組氨酸替代優(yōu)化HTK液可明顯減輕肝細(xì)胞的凋亡指數(shù)。從抗氧化劑和能量底物分析,UW液含谷胱甘肽及別嘌呤醇等抗氧化劑,CS液含谷胱甘肽,HTK液無抗氧化劑。大量研究發(fā)現(xiàn),在低溫保存液添加生物抗氧化劑[10](如還原性谷胱甘肽[11]、氮乙酰半胱氨酸[12]、過氧化氫酶[8]等),可以提高凍存肝細(xì)胞存活率,減輕低溫保存復(fù)溫后大量氧自由基生成引起的細(xì)胞凋亡。綜上,HTK液的強(qiáng)大酸堿緩沖系統(tǒng)-組氨酸緩沖系統(tǒng)可能并不是很適宜肝細(xì)胞的低溫保存,同時(shí)UW液、Celsior液含有抗氧化的還原性谷胱甘肽可能是對(duì)肝細(xì)胞的低溫保存效果優(yōu)于HTK液的原因。

總之,同HTK液相比,使用UW液或者CS液4℃保存肝細(xì)胞可明顯的提高復(fù)溫后C3A細(xì)胞存活率,降低低溫?fù)p傷引起的ALT釋放和乳酸釋放,有效的保護(hù)C3A肝細(xì)胞尿素合成功能和清蛋白分泌功能。UW液或者Celsior液4℃保存C3A肝細(xì)胞仍然可以滿足BLASS的需要,但不宜超過72 h。

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