馬哲龍，蔣福升，俞婷婷，俞 燕，陳建真 ，丁志山

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州 310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310053；3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江杭州 310053

山核桃（Carya cathayensis Sarg.）為胡桃科山核桃屬植物，主要分布于浙、皖兩省交界的天目山區(qū)周圍，尤以臨安、昌化為佳，具有明顯的地域分布特性[1]。山核桃具有廣泛的藥理作用，山核桃樹皮具有清熱解毒、抗菌消炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗腫瘤的作用，山核桃外果皮具有抗炎鎮(zhèn)痛、抑菌消炎的作用，山核桃葉片提取物有很好的抑菌作用，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、酵母菌、黃曲霉菌、青霉菌和黑曲霉菌均有效[2-7]。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)山核桃葉提取物有抑制SGC-7901細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)該腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[8]。因此，筆者經(jīng)過對山核桃葉提取物進(jìn)行分離，并首次從中得到球松素查兒酮（DHMC）。目前有關(guān)DHMC藥理作用的研究很少，僅少量文獻(xiàn)報(bào)道DHMC具有選擇性抗利什曼原蟲的作用[9]，經(jīng)過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，DHMC不僅對腫瘤細(xì)胞有較好的抑制作用，而且還具有抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及舒張血管等作用，可用于進(jìn)一步開發(fā)防治動脈粥樣硬化等心血管疾病的藥物。目前已報(bào)道的含有DHMC的物質(zhì)很少，且含量不高。本試驗(yàn)建立了HPLC測定山核桃樹葉中DHMC含量的方法，為以后進(jìn)一步開發(fā)DHMC的藥用價(jià)值提供參考。

1 儀器與試藥

儀器：Dionex高效液相色譜儀（美國戴安公司）、萬分之一精密電子天平（AR2130 Ohaus Corp.Pine Brook，NJ，USA）、KQ-3200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率（150 W，頻率 40 kHz）。

試藥：色譜級甲醇（臨海市浙東特種試劑廠）、甲醇（杭州大方化學(xué)試劑廠）、水為雙蒸水；山核桃葉（采自浙江臨安，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)陳錫林副教授鑒定為山核桃（Carya cathayensis Sarg.）的樹葉；對照品：DHMC（實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)NMR鑒定其結(jié)構(gòu)，HPLC峰面積歸一法檢測含量為99.4%）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 供試品溶液的制備 取適量山核桃葉粉碎，過40目篩，稱取粉末約0.25 g，精密稱定，置于25 ml容量瓶中，精密加入25 ml甲醇，稱定重量，超聲處理30 min，取出待冷卻后，再次稱定重量，用溶劑補(bǔ)足減失重量，取續(xù)濾液0.5 ml，定容至10 ml容量瓶中，搖勻，過0.45 μm濾膜，即得山核桃葉供試品溶液。

2.1.2 對照品貯備液的制備 精密稱取減壓干燥的DHMC對照品5 mg，置10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.5 mg/ml的對照品貯備溶液。

2.1.3 對照品溶液的制備 精密量取對照品貯備液2.0 ml，置50 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，從中吸取5 ml，用甲醇定容至25 ml，搖勻，即得0.004 mg/ml的對照品溶液。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱為 Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-水（65∶35，V/V），流速為 1.0 ml/min，檢測波長為 342 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μl。在此條件下DHMC達(dá)到基線分離。結(jié)果見圖1。

圖1 DHMC對照品和山核桃葉HPLC圖譜

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下的對照品貯備液1 ml，置50 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取2、4、6、8、10 μl，注入色譜儀進(jìn)行測定，記錄色譜圖，以對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y），求得回歸方程為：Y=7.8868X-0.0409（r=0.9996）。 結(jié)果表明，DHMC 進(jìn)樣量在0.02～0.10 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 DHMC的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取0.004 mg/ml DHMC對照品溶液10 μl，注入色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定DHMC的色譜峰面積值，求得峰面積的RSD為1.1%（n=6）。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液10 μl，注入色譜儀，按 0、1、2、3、4、5 h 間隔進(jìn)樣，測得 DHMC 的色譜峰面積，求得峰面積的RSD為0.9%（n=6）。結(jié)果表明，供試品溶液在室溫條件下5 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批藥材，按“2.1.1”項(xiàng)下的方法平行制備6份供試品溶液并依法測定DHMC的色譜峰面積，求得峰面積RSD為0.9%（n=6），結(jié)果表明本法重現(xiàn)性良好。

2.3.5 加樣回收試驗(yàn) 取已知DHMC含量的山核桃葉粉碎，過40目篩，稱取藥材粉末約0.125 g，精密稱定，研細(xì)，共稱取6份， 分別精密加入對照品貯備液 （0.5 mg/ml）1.6、1.6、2.0、2.0、2.4、2.4 ml，再按“2.1.1”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，并依法測定，記錄色譜峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算出DHMC的回收率分別為 99.47%、99.71%、102.5%、101.4%、104.3%、102.3%，平均回收率為 101.6%，RSD=1.8%（n=6）。

2.4 樣品含量測定

取“2.1.3”項(xiàng)下的對照品溶液和“2.1.1”項(xiàng)下的山核桃葉供試品溶液各10 μl進(jìn)樣測定，按上述色譜條件測定峰面積，外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果山核桃葉中DHMC的含量為7.916 mg/g，達(dá) 0.79%。

3 討論

試驗(yàn)過程中采用了100%、80%和60%的甲醇溶液提取，三者均可得到較好的分離效果，且測得的結(jié)果無明顯差異，鑒于便捷性和穩(wěn)定性考慮，采用100%甲醇為提取溶劑；在提取方法的選擇上，采取超聲提取和水浴回流提取兩種方法作對比，二者測得的結(jié)果無明顯差異，從簡便和節(jié)能上考慮，采用了超聲處理法提?。辉诹鲃酉噙x擇上，對兩種洗脫系統(tǒng)進(jìn)行比較，即乙腈-水（65∶35）、甲醇-水（65∶35），結(jié)果顯示采用甲醇-水（65∶35）為流動相，峰形與分離效果最好，故選擇甲醇-水（65∶35）為流動相。本實(shí)驗(yàn)首次對山核桃葉中的DHMC成分進(jìn)行了方法學(xué)考察的研究，對提取時(shí)間、提取溶媒、提取方法及HPLC條件進(jìn)行了篩選，初步為DHMC的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究及含量測定建立了可靠簡便的方法，也為山核桃葉的開發(fā)利用提供了寶貴的資料。

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