李鑫元，郭榮勝，李元鑫，鄒永艷，徐春梅，周振坤△

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150086;2.山東省威海市中醫(yī)院，山東威海264200;3.黑龍江省中醫(yī)研究院，黑龍江哈爾濱150036)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)簡(jiǎn)稱類風(fēng)濕，是一種慢性、系統(tǒng)性及炎癥性疾病，主要累及四肢小關(guān)節(jié)及某些內(nèi)臟。過(guò)去認(rèn)為本病屬膠原系統(tǒng)疾病，現(xiàn)已證明類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎主要是以對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的異質(zhì)性系統(tǒng)性疾病，病變的主要位置是關(guān)節(jié)的滑膜，其次為漿膜，心、肺、血管、神經(jīng)及眼等結(jié)締組織也可廣泛發(fā)生的免疫性疾病，病程遷延。

在前期研究中，筆者通過(guò)實(shí)驗(yàn)，做了A－A大鼠模型足腫脹針灸方案優(yōu)選療效的初步觀察。結(jié)果證實(shí)，針灸治療RA有肯定的臨床療效，能緩解RA的局部癥狀，減輕關(guān)節(jié)腫脹。

盡管RA是一種全身性的免疫性疾病，而局部病變是RA病的最主要的臨床表現(xiàn)，其基本特征是關(guān)節(jié)滑膜炎，ICAM－1是最重要的白細(xì)胞－內(nèi)皮細(xì)胞間粘附分子之一，介導(dǎo)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的粘附及白細(xì)胞穿出血管壁這一復(fù)雜過(guò)程，在炎癥過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。既然針灸對(duì)RA臨床癥狀的改善具有良好的效果，對(duì)A－A大鼠的足腫脹度具有明顯的消腫作用，那么，針灸對(duì)于RA局部病理變化及ICAM－1的表達(dá)有何影響?在此研究基礎(chǔ)上，筆者對(duì)針灸治療A－A大鼠模型的療效進(jìn)行進(jìn)一步觀察，以A－A的病理形態(tài)學(xué)變化及局部病理組織中ICAM－1表達(dá)為指標(biāo)，以優(yōu)選出針灸治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的最佳治療方案。

在本實(shí)驗(yàn)中用氟氏完全佐劑建立了大鼠關(guān)節(jié)炎模型，許多放射學(xué)研究結(jié)果一致認(rèn)為，A－A模型是針對(duì)長(zhǎng)期病理學(xué)改變研究RA的較為理想的動(dòng)物模型。本研究中，仍以A－A大鼠模型為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，實(shí)驗(yàn)方法運(yùn)用正交設(shè)計(jì)的原理，選用整體取穴、局部取穴和病程為三因素，把火針、艾灸、毫針和對(duì)應(yīng)病程(誘導(dǎo)后3天、7天、14天)列為三水平，從A－A的病理形態(tài)學(xué)變化及局部病理組織中ICAM－1表達(dá)方面對(duì)針灸治療A－A大鼠模型的療效進(jìn)行進(jìn)一步觀察。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠120只，雌性，體重145～170 g，6～8周齡，合格證號(hào):黑動(dòng)字P00102005。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

氟氏完全佐劑(Freund＇s Complete Adjuvant，F(xiàn)CA)美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，批號(hào):102k8930，內(nèi)含0.1%滅活分支桿菌;ICAM－1免疫組化試劑合，批號(hào):BA0541;8%多聚甲醛、EDTA、多聚－L－賴氨酸、磷酸鹽緩沖液(PBS):PH 7.4、檸檬酸緩沖液:0.01M PH 6.0、抗體稀釋液、DAB顯色試劑合;光學(xué)顯微鏡(BH－2型)日本Olympus公司;毫針采用華佗牌針灸針，規(guī)格0.28 mm×15 mm;艾灸:以艾絨制麥粒大艾柱;火針:賀氏細(xì)火針。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型建立

氟氏完全佐劑誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)炎A－A模型的建立方法:右后足墊部皮內(nèi)注入FCA 0.1 ml于每只大鼠，建成A－A大鼠模型。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組

參照正交設(shè)計(jì)的方法，分析影響療效的因素，采用病程、局部取穴和整體取穴為三因素，局部與整體有交互作用，把毫針、火針、艾灸列為三水平。選取L9(34)正交設(shè)計(jì)表，將120只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型隨機(jī)分成10組，每組12只，設(shè)立1組為模型對(duì)照觀察組，其余9組隨機(jī)分入9組實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)行療效觀察。

2.3 治療方法

取穴方法:以華興邦等［1～2］研制的“大鼠穴位圖譜”為依據(jù)，參考比較解剖和骨度分寸法，模擬定位。整體取穴為:腎俞、大椎;局部取穴為:趾間、足三里。火針每3天1次，速刺，不留針。毫針、艾灸每2天1次，毫針留針30 min，艾灸時(shí)剪去穴位上鼠毛施灸，每穴3壯。各組均常規(guī)局部消毒后進(jìn)行治療，一療程為30天。

2.4 觀察指標(biāo)及制備方法

2.4.1 病理切片制備

快速頸椎脫位處死大鼠，立即除皮，切取足踝掌部，立即放入8%多聚甲醛溶液中固定，經(jīng)EDTA脫鈣，常規(guī)梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片，片厚約3～5 μm，分別用于HE染色觀察和免疫組織化學(xué)染色。HE染色下觀察炎細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜增生，血管翳形成，軟骨破壞。采用免疫組織化學(xué)的方法觀察關(guān)節(jié)滑膜組織ICAM－1蛋白的表達(dá)。

2.4.2 病理情況定量分析

HE染色按照病變的嚴(yán)重程度給予“+”、“++”、“+++”不同級(jí)別的定量。求病理系數(shù)=(炎癥分值+滑膜分值+血管翳分值+軟骨分值)/理論最大值。①炎癥由輕到重分為4級(jí):+輕度，記1分;++中度，記2分;+++重度，記3分;++++重度伴有壞死，記4分。②滑膜增生分3級(jí):+輕度，記1分;++中度，記2分;+++重度，記3分。③血管翳形成:+記5分。④軟骨破壞:+記10分。

2.4.3 ICAM － 表達(dá)分析

按照陰性(－):免疫反應(yīng)陽(yáng)性，產(chǎn)物無(wú)黃色記1分;輕度陽(yáng)性(+):免疫反應(yīng)陽(yáng)性，產(chǎn)物呈淡棕黃色記2分;中度陽(yáng)性(++):免疫反應(yīng)陽(yáng)性，產(chǎn)物呈棕黃色記3分;強(qiáng)陽(yáng)性(+++):免疫反應(yīng)陽(yáng)性，產(chǎn)物呈深棕黃色記4分。

3 統(tǒng)計(jì)分析

正交分析按照直觀分析及方差分析，各組間比較用F檢驗(yàn)，前后自身比較用t檢驗(yàn)。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各組造模前后右足腫脹比較有明顯差異，造模成功，各組間比較經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無(wú)差異，說(shuō)明各組間有可比性［3］。

4.1 A－A大鼠足部病理切片的觀察比較

各干預(yù)組大鼠病理鏡下所見(jiàn):第1組，滑膜重度增生，呈乳頭樣突出，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管翳形成，血管(炎)增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn);第2組，滑膜上皮中度增生，組織粘連，血管增生，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，血管翳形成;第3組，滑膜重度增生并水腫，可見(jiàn)有淋巴細(xì)胞，漿細(xì)胞大量浸潤(rùn)，組織壞死;第4組，滑膜上皮輕度增生，有炎細(xì)胞浸潤(rùn);第5組，滑膜上皮輕度增生，炎細(xì)胞浸潤(rùn);第6組，滑膜上皮中度增生，血管增生，炎細(xì)胞浸潤(rùn);第7組，滑膜上皮重度增生，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，血管上皮增生，纖維變性，血管翳形成;第8組，滑膜上皮輕度增生血管增生，炎細(xì)胞浸潤(rùn);第9組，滑膜增生不明顯，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，血管增生。見(jiàn)圖1～8。

統(tǒng)計(jì)分析:各病理嚴(yán)重程度按照前述的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，取平均值相加，除以理論最大值即為各組的病理程度系數(shù)，系數(shù)越小，說(shuō)明病變程度越輕，干預(yù)效果越好。列正交設(shè)計(jì)表及各組干預(yù)結(jié)果如表1。

圖1 第1組血管翳形成×100

圖2 第2組血管增生×100

圖3 第3組組織壞死×400

圖4 第4組滑膜上皮輕度增生×100

圖5 第6組血管增生，炎細(xì)胞浸潤(rùn)×100

圖6 第7組血管上皮增生，纖維變性×100

圖7 第8組滑膜上皮輕度增生，血管增生×100

圖8 第9組滑膜增生不明顯，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，血管增生×100

表1 各組病理評(píng)分系數(shù)正交分析表

由表1可見(jiàn)，對(duì)A－A大鼠病理干預(yù)因素的排列由大到小為A＞B＞C＞D，優(yōu)化條件為A2B2C2D3。進(jìn)一步做方差分析由于D值最小，將其作為誤差進(jìn)行比較，見(jiàn)表2。

表2 病理評(píng)分系數(shù)正交方差分析

根據(jù)極差分析的結(jié)果，優(yōu)選方案為A2B2D3。

經(jīng)F檢驗(yàn)，只有A變異的P＜0.05，其余各變異無(wú)顯著性差異，說(shuō)明A因素是為干預(yù)的主要因素，取其較好值為A2;C、D因素差值極小，說(shuō)明對(duì)病理的干預(yù)影響不大，幾無(wú)影響，而C因素為A×B的影響，說(shuō)明在本實(shí)驗(yàn)中二者交互作用不大，故B可以任選，B2、B3皆可選用;D因素的影響最小，比空列C的極差還小，說(shuō)明在本次實(shí)驗(yàn)中所劃分的病程沒(méi)有對(duì)病理變化起到多大的影響，也許和病程之間的間距太短有關(guān)，這更加說(shuō)明了RA是一個(gè)慢性而長(zhǎng)期的病理過(guò)程。另外，A因素作為局部因素，結(jié)合消腫率的結(jié)果，說(shuō)明局部治療對(duì)A－A具有直接而重要的意義。故其優(yōu)選方案為A2B(2，3可看情況任選)。

4.2 局部病理組織中ICAM－1的表達(dá)觀察比較

ICAM－1顯微鏡下所見(jiàn):病理切片按免疫組織化學(xué)染色后顯微鏡下觀察，正常對(duì)照組雙側(cè)滑膜上皮及滑膜纖維膜呈陰性或微陽(yáng)性表達(dá)。A－A大鼠左后足滑膜上皮及滑膜纖維膜均呈陽(yáng)性表達(dá)，右足滑膜上皮及纖維膜也均成陽(yáng)性表達(dá)，而以纖維膜的表達(dá)明顯。其余治療組均取右足。第1組見(jiàn)滑膜上皮及滑膜纖維膜陽(yáng)性表達(dá);第2組見(jiàn)滑膜上皮及滑膜纖維膜的表達(dá)，血管內(nèi)皮也有表達(dá);第3組，滑膜纖維膜表達(dá)陽(yáng)性;第4組滑膜上皮及纖維膜成陰性表達(dá);第5組滑膜上皮及纖維膜成陽(yáng)性表達(dá);第6組滑膜上皮及血管內(nèi)皮陽(yáng)性表達(dá);第7組滑膜上皮及纖維膜呈陽(yáng)性表達(dá);第8組滑膜上皮有輕微表達(dá);第9組滑膜上皮可見(jiàn)有弱陽(yáng)性表達(dá)。見(jiàn)圖9～13。

ICAM－1表達(dá)的分析比較，程度按照前述的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，取小值為表達(dá)輕微。列正交表及各干預(yù)組評(píng)分結(jié)果如表3。

圖9 模型組ICAM－1表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性(右)×100深棕黃色

圖10 正常對(duì)照ICAM－1表達(dá)陰性×100

圖11 第3組ICAM－1表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性×100呈深棕黃色

圖12 第4組ICAM－1表達(dá)陰性×100

圖13 第4組ICAM－1表達(dá)輕微×100

表3 ICAM－1表達(dá)評(píng)分正交分析表

表4 ICAM－1表達(dá)評(píng)分正交方差分析

從表3、4可以看到，經(jīng)方差分析，各組均未取得顯著意義，即各因素尚不能確定哪個(gè)為影響ICAM－1的主要因素;通過(guò)級(jí)差分析，可以直觀看到影響ICAM－1的因素由大到小排列為A＞C＞B＞D，A因素級(jí)差最大，是為主要因素，取較好值為A3，其余各因素相差不大，可以任意取。按照極差分析的結(jié)果，可取A3C2B2D3。

5 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是以慢性滑膜炎為特征，最終導(dǎo)致軟骨吸收、骨破壞和骨纖維化的自身免疫性疾病。RA滑膜的特征性改變?yōu)?滑膜A型細(xì)胞增殖、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、多形核細(xì)胞聚集以及滑膜成纖維細(xì)胞增殖和纖維沉積。其中T細(xì)胞激活是炎癥的核心。隨后引起一系列的炎癥免疫反應(yīng)，導(dǎo)致滑膜增生、血管翳形成、軟骨侵蝕、變性壞死，這一過(guò)程是個(gè)慢性發(fā)展過(guò)程，很難完全阻斷，但臨床又有自行緩解的。在本次實(shí)驗(yàn)中，干預(yù)組仍存在不同程度的滑膜炎癥，甚至有血管翳的形成，但可以看到干預(yù)組在病變程度上要比模型組輕微，且沒(méi)有軟骨病變形成，在一定程度上說(shuō)明了針灸干預(yù)對(duì)于A－A大鼠的病變進(jìn)程具有延緩作用。而以A2為最主要因素，說(shuō)明局部的火針治療對(duì)于改善局部病理狀態(tài)具有重要價(jià)值。

上述炎癥過(guò)程中粘附分子(Adhesion molecules，ADMS)起著重要的作用。首先，粘附分子可介導(dǎo)循環(huán)中的白細(xì)胞粘附于滑膜高內(nèi)皮小靜脈，并向血管外游出，聚集于滑膜，循環(huán)中的白細(xì)胞從血管移行到周圍組織是關(guān)節(jié)急性炎癥的一個(gè)標(biāo)志，而慢性細(xì)胞免疫反應(yīng)即淋巴細(xì)胞在關(guān)節(jié)滑膜的浸潤(rùn)則是RA的免疫學(xué)特征。在上述過(guò)程中，粘附分子充當(dāng)重要角色。它是介導(dǎo)細(xì)胞間和細(xì)胞與胞外基質(zhì)間相互結(jié)合的細(xì)胞表面受體，參與介導(dǎo)細(xì)胞遷移、淋巴細(xì)胞活化、吞噬及靶細(xì)胞殺傷等多種作用;其次，可促進(jìn)細(xì)胞間的接觸，并在抗原呈遞和細(xì)胞激活過(guò)程中提供輔助刺激因子;第三，使白細(xì)胞粘附于細(xì)胞外基質(zhì)成分并停滯在炎癥局部［4］。炎癥細(xì)胞一旦進(jìn)入滑膜即產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子，如TNF－a、IL－1β、IL－6等，造成滑膜炎性病變而破壞關(guān)節(jié)，上述細(xì)胞因子反過(guò)來(lái)又可通過(guò)上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞表面粘附分子表達(dá)而招致更多的白細(xì)胞浸潤(rùn)［5］在早期RA患者，滑膜粘附分子表達(dá)的上調(diào)提示病情活動(dòng)。

可以說(shuō)ADMS影響著RA的4個(gè)病理期，國(guó)外Aori S等［6］發(fā)現(xiàn)，可溶性細(xì)胞粘附分子(sICAM －1)在RA患者外周血中的水平與其關(guān)節(jié)破壞的輕重程度呈正相關(guān)。近年來(lái)，許多學(xué)者探索用抗粘附分子或其受體的單克隆抗體治療RA。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床前期試驗(yàn)證實(shí)，粘附分子的單抗可以成功地阻斷及減輕RA的嚴(yán)重程度［7］。Arthur認(rèn)為其機(jī)理是抗ICAM－1的單抗可抑制炎癥滑膜內(nèi)皮細(xì)胞上的ICAM－1，因此能阻止T細(xì)胞進(jìn)入滑膜。

ICAM－1可廣泛表達(dá)于RA滑膜組織巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞、滑膜襯里細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，且較OA廣泛［8］，本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)針灸治療對(duì)A－A大鼠病理局部的ICAM－1的表達(dá)具有一定的影響，隨著病理程度的不同而ICAM－1的表達(dá)也發(fā)生改變，在模型組ICAM－1呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，治療組除第1組外均較陽(yáng)性組為輕微，并且有陰性表達(dá)。從微觀的病理變化到直觀的腫脹變化證實(shí)了針灸對(duì)RA治療的有效性，針灸治療下調(diào)了滑膜組織ICAM－1的表達(dá)，減輕了炎癥反應(yīng)，減緩了病理進(jìn)程。

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