王剛，常明泉，楊光義，曾南，葉方

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院藥學(xué)部，湖北十堰 442000;2.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，610075)

槲皮素(quercetin，QUE)為一種天然的黃酮類化合物，槐米、款冬花、高良姜、側(cè)柏葉、桑寄生等許多中藥均含有該成分。槲皮素能通過多種途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，是目前最強(qiáng)的抗腫瘤藥物之一［1］。國外I和II期臨床試驗(yàn)證實(shí)，槲皮素在體內(nèi)能抑制多種腫瘤進(jìn)展，并且在美國和歐洲一些國家已經(jīng)上市。然而，由于槲皮素不溶于水，導(dǎo)致吸收受限，生物利用度低，難以在腦組織中達(dá)到有效的治療濃度［2］，限制槲皮素抗腦膠質(zhì)瘤應(yīng)用。筆者在本實(shí)驗(yàn)采用乳化蒸發(fā)-低溫固化法制備槲皮素長循環(huán)納米脂質(zhì)體(long circulating nano-liposomes of quercetin，QUE-LCL)，以正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化的制備工藝制備QUE-LCL，并對其理化性質(zhì)及小鼠口服吸收特性進(jìn)行研究，報(bào)道如下。

1 材料

1.1 試藥 山崳酸甘油酯(武漢祥和精細(xì)化工有限公司，批號(hào):100305)，大豆卵磷脂(武漢祥和精細(xì)化工有限公司，批號(hào):100310)，膽固醇(武漢祥和精細(xì)化工有限公司，批號(hào):100305)，聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG2000-DSPE，武漢祥和精細(xì)化工有限公司，批號(hào):100305)、聚山梨酯-80(上?；瘜W(xué)試劑廠，批號(hào):20081006)，泊洛沙姆188(武漢祥和精細(xì)化工有限公司，批號(hào):100310)，槲皮素(自制，批號(hào):20100714，純度:89.8%)，槲皮素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào):100081-200406)，甲醇為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 戴安3000型高效液相色譜儀，DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市英峪予華儀器廠)，Zetasizer3000粒徑測定儀(英國Malvem公司)，TGL-16G臺(tái)式高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，JEM-2010透射電子顯微鏡(日本電子公司)，電子天平(熊貓集團(tuán)南京電子計(jì)量有限公司)。

1.3 動(dòng)物 昆明種小鼠，體質(zhì)量(20±3)g，湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證:SCXK(鄂)2005-0008;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證:SYXK(鄂)2005-0031。

2 方法與結(jié)果

2.1 QUE-LCL 的制備

2.1.1 水相溶液的制備 稱取一定比例的泊洛沙姆和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(1∶1)，加入適量聚山梨酯-80構(gòu)成水相，水浴加熱至(75±5)℃。

2.1.2 油相溶液的制備 精確稱取適量山崳酸甘油酯和膽固醇，80℃水浴熔融;精確稱取適量槲皮素和大豆卵磷脂，共溶于適量丙酮∶三氯甲烷(1∶1)溶劑中，混合后成油相。

2.1.3 QUE-LCL制備 采用乳化蒸發(fā)-低溫固化法制備，以正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化的處方與制備工藝制備QUELCL，其中大豆卵磷脂∶膽固醇∶PEG 2000-DSPE=(2∶1∶1)，藥脂質(zhì)量比=1∶10。將水相置于75℃水浴中，以600～800 r·min-1轉(zhuǎn)速攪拌0.5 h，采用6 號(hào)針頭將油相注入水相中(注射速度2mL·min-1)，進(jìn)行包封，攪拌2 h。然后將攪拌的脂質(zhì)體置于－2℃冰水浴中進(jìn)行低溫固化，加冰水約10mL，攪拌1 h，制得納米脂質(zhì)體混懸液［3］。

2.2 QUE-LCL包封率的測定

2.2.1 測定波長的選擇 分別加入甲醇溶解并稀釋空白納米脂質(zhì)體和含藥納米脂質(zhì)體，制成澄清溶液，在200～400 nm波長紫外掃描，槲皮素在254 nm波長處有顯著的吸收峰，而空白納米脂質(zhì)體無吸收峰。因此選擇測定波長為254 nm。高效液相色譜(HPLC)圖譜表明，槲皮素對照品和槲皮素納米脂質(zhì)體在254 nm處均有顯著的吸收峰，保留時(shí)間約為10.31 min。

2.2.2 色譜條件 色譜柱:Diamonsil-C18柱(250mm×4.6mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇-4.3% 乙酸溶液(55∶45);流速為1.0mL·min-1;檢測波長為254 nm;柱溫30 ℃［4］;進(jìn)樣量 20 μL。

2.2.3 對照品溶液的制備 精密稱取在105℃減壓干燥至恒質(zhì)量的槲皮素對照品2.0 mg，加甲醇超聲溶解，定容至10mL的溶液，即得。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別吸取槲皮素對照品溶液 0.1，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0mL 至 10mL 棕色量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得 2.0，40，80，120，160，200 μg·mL-1的對照品溶液，精密吸取 20 μL 進(jìn)樣，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件測定，重復(fù)操作3次，以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，濃度(C)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:A=1.343 5C－1.490 4(r=0.999 6)，結(jié)果表明:槲皮素在 2.0 ～200.0 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 供試品溶液的制備 用高速離心法分離脂質(zhì)體與游離藥物。精密吸取槲皮素納米脂質(zhì)體混懸液1.0mL，置于塑料小管中，16 000 r·min-1高速離心15 min，取上清液進(jìn)樣測定，即得游離藥物(W游)。精密量取槲皮素脂質(zhì)體溶液1.0mL，置10mL棕色量瓶中，加入10%Triton X-100乙醇溶液0.5mL破乳，甲醇溶液定容至刻度，搖勻。HPLC法測定1.0mL脂質(zhì)體混懸液中總藥物量(W總)(空白脂質(zhì)體混懸液在同樣條件下處理，在藥物峰位處無干擾)。HPLC法測定藥物濃度，計(jì)算包封率。包封率計(jì)算方法如下:包封率=(1－W游/W總)×100%。按優(yōu)化處方制備 QUELCL混懸液3批，測定其包封率，3次測定結(jié)果分別為91.37%，92.45%，91.49%，平均包封率為91.77%。

2.3 QUE-LCL粒徑、形態(tài)的檢測 以5%葡萄糖溶液稀釋納米脂質(zhì)體混懸液，取上述稀釋樣品適量，經(jīng)2%磷鎢酸染色于透射電鏡下觀察粒子形態(tài)為球狀或類球狀粒子(圖1)。在測量小杯中置激光粒度分析儀檢測其粒徑分布，結(jié)果制備的槲皮素納米脂質(zhì)體的平均粒徑為172.6 nm，粒徑范圍為100～300 nm。

圖1 槲皮素納米脂質(zhì)體的透射電鏡照片(×1 000)Fig.1 Transmission electron image ofquercetin nanoliposomes(×1 000)

2.4 小鼠灌胃槲皮素納米脂質(zhì)體吸收實(shí)驗(yàn) 昆明種小鼠60只，體質(zhì)量為(20±2)g，隨機(jī)分為3組，槲皮素原料藥組、QUE-LCL混懸液組、普通脂質(zhì)體組，每組20只。將以上小鼠給藥前禁食12 h，自由飲水。分別灌胃給予槲皮素原料藥(槲皮素混懸于4%羧甲基纖維素鈉)和槲皮素納米脂質(zhì)體混懸液，給藥劑量均為50 mg·kg-1，給藥后于 l，3，6，9，12 h 處死小鼠，每次處死4只，立即取出自食管下端至肛門的內(nèi)容物，并用無水乙醇清洗胃腸道管壁，同時(shí)收集實(shí)驗(yàn)開始到取樣時(shí)間的所有糞樣，合并。

2.4.1 樣品處理 取胃腸道內(nèi)容物和糞樣的混合物，加入無水乙醇約80mL，超聲提取約1 h后，過濾，用無水乙醇洗滌殘?jiān)⒍ㄈ葜?00mL。

2.4.2 測定波長的確定 按“2.4.1”項(xiàng)處理空白胃腸道內(nèi)容物與糞樣混合物，及含有QUE或含有QUELCL的胃腸道內(nèi)容物及糞樣混合物后，于200～500 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，含 QUE與 QUELCL的樣品處理后在254 nm波長處有最大吸收，空白胃腸道內(nèi)容物及糞樣的混合物在此波長處無干擾，而空白納米脂質(zhì)體經(jīng)乙醇處理后在254 nm處也無干擾，故在此波長處測定小鼠口服給藥一定時(shí)間后在胃腸道中以及排出體外的藥物。

2.4.3 色譜條件 色譜柱:Diamonsil-C18柱(250mm×4.6mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇-4.3% 乙酸溶液(55∶45);流速為1.0mL·min-1;檢測波長為254 nm;柱溫30 ℃［4］;進(jìn)樣量 20 μL。

2.4.4 線性關(guān)系考察 精密稱取槲皮素對照品50 mg，置于50mL量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度。分別精密吸取 0.2，2.0，4.0，8.0，10.0，20.0mL，加入空白胃腸道內(nèi)容物和糞樣的混合物中，樣品處理方法按“2.4.1”處理，分別配置成 2.0，20.0，40.0，80.0，100.0，200.0 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，精密吸取20 μL進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:A=0.090 8C+0.157(r=0.999 2)，結(jié) 果 表明:槲 皮 素 在 2.0 ～200.0 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取槲皮素對照品按照“2.4.1”項(xiàng)下方法平行制備6份樣品溶液，測定并計(jì)算含量，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.86%。

2.4.6 精密度實(shí)驗(yàn) 槲皮素對照品按照“2.4.1”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，精密吸取20 μL連續(xù)進(jìn)樣6次，按照上述色譜條件，測定，計(jì)算含量，RSD為1.65%。

2.4.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取槲皮素對照品溶液，按照“2.4.1”項(xiàng)下方法制備，于室溫(20～25℃)下放置，分別于0，2，4，6，8，10 h 精密吸取 20 μL 進(jìn)樣，測定峰面積，并計(jì)算含量，RSD為1.84%。

2.4.8 回收率實(shí)驗(yàn) 選擇在 2.0 ～200.0 μg·mL-1范圍內(nèi)高、中、低3個(gè)濃度槲皮素對照品，添加槲皮素對照品溶液1.2，1.5，1.8mL，每個(gè)梯度平行 3 份;分別按“2.4.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，計(jì)算得槲皮素的平均回收率分別為98.9%(RSD 為1.71%)，99.3%(RSD 為1.89%)和 97.4%(RSD 為1.91%)。

2.4.9 吸收百分率的測定 通過測定口服劑量(X1)及小鼠胃腸道及糞便中剩余的藥物量(X2)，利用公式:吸收百分率(%)=(X1－X2)/X1×100%，求得藥物吸收百分率。見表1。結(jié)果表明槲皮素原料藥吸收少，12 h的吸收不到60%;槲皮素普通脂質(zhì)體吸收較少，12 h的吸收不到70%;而槲皮素制成長循環(huán)納米脂質(zhì)體后，吸收百分率明顯提高，12 h的藥物吸收＞90%，吸收完全。

表1 槲皮素口服吸收百分率Tab.1 Oral absorption rate of quercetin %

3 討論

研究表明，槲皮素水溶性與脂溶性均較差［5］，本研究通過采用聚乙二醇-二硬脂?；字Ｒ掖及?PEG2000-DSPE)為修飾膜材，采用乳化蒸發(fā)-低溫固化法制備QUE-LCL，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明以PEG2000-DSPE與聚山梨酯-80作為乳化劑可增加槲皮素納米脂質(zhì)體的包封率，此外，本實(shí)驗(yàn)采用山崳酸甘油酯、大豆卵磷脂和膽固醇作為油相于80℃水浴熔融槲皮素，能更好地使藥物熔融于油相中，與制備的槲皮素普通脂質(zhì)體相比較，本實(shí)驗(yàn)制備方法在增加槲皮素溶解度的同時(shí)提高包封率。

由于槲皮素在吸收過程中存在生物轉(zhuǎn)化［6］，多種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)入血液，在血液循環(huán)中藥物的清除極快，槲皮素在2 h后就已檢測不到，故不宜采用槲皮素血藥濃度法考察其制劑的吸收情況。研究表明，槲皮素主要經(jīng)胃腸易化擴(kuò)散吸收分布于胃腸道［7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明槲皮素制備成長循環(huán)納米脂質(zhì)體后在胃腸組織分布濃度很高，制劑中的槲皮素長時(shí)間黏附于小腸壁(10～12 h)，且不易被排入大腸，而槲皮素原料藥在小鼠腸道中迅速通過小腸進(jìn)入大腸(約6 h)，并隨大便排出。說明槲皮素制備成長循環(huán)納米脂質(zhì)體有較好的胃腸黏附性，可有效延長藥物與胃腸黏膜的接觸時(shí)間，從而提高藥物在腸道中的吸收。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過研究槲皮素及其在胃組織的藥物濃度和口服吸收百分率，為槲皮素的新制劑開發(fā)和應(yīng)用墊定基礎(chǔ)。

［1］MURAKAMI A，ASHIDA H，TERAO J.Mutitargeted cancer prevention by quercetin ［J］.Cancer Lett，2008，269(2):315－325.

［2］UPPUGUNDLA N，ENGELBERTH A，VANDHANA RAVINDRANATH S，et al.Switchgrass water extracts:extraction，separation and biological activity of rutin and quercetin［J］.J Agric Food Chem，2009，57(17):7763－7770.

［3］XU F，YUAN Y，SHAN X，et al.Long-circulation of hemoglobin-loaded polymeric nanoparticles as oxygen carriers with modulated surface charges［J］.Int J Pharm，2009，377(1－2):199－206.

［4］YANG X，ZHANG X，YUAN Z，et al.Simultaneous determination of myricitrin，hyperin，quercitroside，and quercetin in folium rhododendrimicranthibyRP-HPLC［J］.J Chromatogr Sci，2009，47(8):714－717.

［5］LAN K，ZHANG Y，YANG J，et al.Simple quality assessment approach for herbal extracts using high performance liquid chromatography-UV based metabolomics platform［J］.J Chromatogr A，2010，1217(8):1414－1418.

［6］MORAND C，CRESPY V，MANACH C，et al.Plasma metabolites of quercetin and their antioxidant properties［J］.Am J Physiol，1998，275(1-2):212－219.

［7］孟德勝，汪士良.槲皮素及其苷類研究進(jìn)展［J］.中國藥房，2000，11(5):232－233.