胡春玲，唐尹萍，施靜妮，劉焱文

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與中藥復(fù)方省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430065)

鱉甲(Trionyx sinensis carapace)為傳統(tǒng)中藥，來源于鱉科動(dòng)物鱉(Trionyx sinensis Wiegmann)的背甲。臨床上，以鱉甲為君藥的多種中藥復(fù)方用于治療肝纖維化療效顯著。單味鱉甲也常用于治療慢性肝病，預(yù)防肝硬化，是臨床上治療肝硬化應(yīng)用最廣的藥物之一［1-2］。筆者前期研究工作已證實(shí)鱉甲煎煮液對(duì)大鼠肝纖維化有較好的抑制作用［3］，并首次從鱉甲中分離出活性成分，藥理實(shí)驗(yàn)證明其抗肝纖維化效果顯著［4-8］，但其來源有限，應(yīng)用受到極大限制。筆者在本實(shí)驗(yàn)中選取鱉甲活性成分之一抗肝纖維化活性多肽(NPNPT，m/z 542.16)進(jìn)行多肽固相合成，經(jīng)反相高效液相分析、純化得到鱉甲合成多肽;并應(yīng)用Annexin VFITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)鱉甲合成多肽作用肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)后細(xì)胞凋亡情況［9-10］，為篩選、尋找抗肝纖維化多肽藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Agilent1100液相色譜儀(Agilent公司);基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(日本島津公司);臺(tái)式冷凍干燥機(jī);二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(日本SANYO公司產(chǎn)品);倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司產(chǎn)品);EEPICSXL型流式細(xì)胞儀(美國BECKMANCOUNTER公司)。

1.1.2 試劑 大鼠肝星狀細(xì)胞系(HSC-T6，浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝病研究所提供);High-DMEM培養(yǎng)基(美國GIBCO公司);胎牛血清(武漢三利生物技術(shù)有限公司);Annexin V-FITC/PI試劑盒(美國羅氏公司);Na-芴甲基氧羰基保護(hù)的氨基酸(Fmoc-AA)、Wang樹脂、1-氧-3-雙二甲胺羰基苯并三氮唑四氟化硼鹽(TBTU，吉爾生化上海有限公司生產(chǎn));其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 鱉甲活性多肽的固相合成 根據(jù)鱉甲NPNPT的氨基酸序列結(jié)構(gòu)，采用固相合成法，以Fmoc保護(hù)氨基酸和Wang樹脂為原料，經(jīng)1-氧-3-雙二甲胺羧基苯并三氮唑四氟化硼鹽(TBTU)、N-甲基嗎啡啉(nmethylmorpholine，NMM)縮合，以20%哌啶的二甲基甲酰胺(dimethylformamide，DMF)溶液進(jìn)行脫保護(hù)，用TFA切割試劑將多肽粗品從Wang樹脂上切割下來。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將HSC-T6培養(yǎng)于含10% 胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 mg·mL-1鏈霉素和 1%NEAA的High-DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%二氧化碳(CO2)、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng);在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞長到亞單層或細(xì)胞密度80%～90%時(shí)，是HSC-T6傳代的標(biāo)志;吸棄培養(yǎng)基，加入0.25%胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，按1∶4傳代。

1.2.3 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)早期細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，以1×105個(gè)·mL-1密度接種于50mL培養(yǎng)瓶中，24 h后加入含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配制的各濃度鱉甲合成多肽(0，0.6，1.2，2.5，5.0 mg·mL-1)培養(yǎng)24 h，收集所有細(xì)胞，根據(jù) Annexin V-FITC/PI試劑盒說明，流式細(xì)胞儀檢測(cè)HSC凋亡。以加入鱉甲合成多肽濃度0 mg·mL-1組為對(duì)照組。

2 結(jié)果

2.1 鱉甲合成多肽的鑒定結(jié)果 采用經(jīng)典的多肽固相合成方法，按照鱉甲抗肝纖維化活性多肽的氨基酸序列從右到左進(jìn)行全合成，經(jīng)反相高效液相色譜分析純化，得純度＞98%的合成肽。其質(zhì)譜圖見圖1。由圖可以得到合成多肽的相對(duì)分子質(zhì)量為542.083，與對(duì)應(yīng)鱉甲抗肝纖維化活性多肽NPNPT(m/z為542.16)的理論相對(duì)分子質(zhì)量一致，證明合成多肽即為目的產(chǎn)物。

圖1 合成多肽N-P-N-P-T的質(zhì)譜鑒定圖Fig.1 Mass spectrum analysis of synthetic peptide N-PN-P-T

2.2 鱉甲合成多肽對(duì) HSC早期凋亡的影響Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)結(jié)果顯示，0.6，1.2，2.5和 5.0 mg·mL-1鱉甲合成多肽與 HSC-T6細(xì)胞作用24 h后，早期凋亡率分別為(9.56±1.27)%，(28.90±3.11)%，(57.96±5.17)%和(87.17±10.85)%，與空白對(duì)照組［早期凋亡率(2.85±0.58)%］比較，均明顯增高;高劑量組之間凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2。

3 討論

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)鱉甲合成多肽對(duì)HSC-T6早期凋亡的影響A.空白對(duì)照組;B.鱉甲合成多肽 0.6 mg·mL-1組;C.鱉甲合成多肽 1.2 mg·mL-1組;D.鱉甲合成多肽 2.5 mg·mL-1組;E.鱉甲合成多肽 5.0 mg·mL-1組;Fig.2 Detection of apoptosis of HSC-T6induced by synthetic peptide of Carapax Trionycis by flow cytometryA.blank control group;B.0.6 mg·mL-1synthetic peptide group;C.1.2 mg·mL-1synthetic peptide group;D.2.5 mg·mL-1 synthetic peptide group;E.5.0 mg·mL-1synthetic peptide group

以鱉甲抗肝纖維化活性成分為先導(dǎo)化合物，進(jìn)行全化學(xué)合成，是當(dāng)今尋找安全、高效抗肝纖維化藥物的重要途徑。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，根據(jù)鱉甲抗肝纖維化活性多肽的序列結(jié)構(gòu)，采用Fmoc固相方法對(duì)多肽進(jìn)行全合成，經(jīng)反相高效液相色譜法分析、純化得到純度高、相對(duì)分子質(zhì)量為與理論值一致的合成多肽，說明通過全合成的方法完全可以得到與天然多肽結(jié)構(gòu)一致的鱉甲合成多肽。

HSC在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［11-12］，有效干預(yù)HSC的生物學(xué)行為則能成功防治肝纖維化，其中誘導(dǎo)活化的肝星狀細(xì)胞凋亡是目前治療肝纖維化的主要機(jī)制之一，Annexin V-FITC/PI雙染法是常見的定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)HSC凋亡，發(fā)現(xiàn)鱉甲合成多肽可以誘導(dǎo)HSC的凋亡，抑制HSC增殖，發(fā)揮抗肝纖維化的功能，且其作用呈劑量依賴性。總之，通過鱉甲多肽的固相合成及Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)鱉甲合成多肽誘導(dǎo)HSC凋亡，為目前篩選、尋找抗肝纖維化多肽藥物提供理論依據(jù)。

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