張愛麗，蘭 婷，李穆瓊，張俊娜，李曉曄

第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系化學(xué)教研室，陜西西安 710032

比阿培南（Biapenem）是在2-位S上具有雙環(huán)三唑的1-β-甲基碳青霉烯。它對(duì)革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌（包括耐藥的銅綠假單胞菌）、厭氧菌等均具有較強(qiáng)的抗菌活性；對(duì)β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定；對(duì)腎脫氫肽酶（DHPE）的穩(wěn)定性較伊米培南強(qiáng)；與其他已上市的碳青霉烯類品種如阿培南腎相比，毒性幾乎為零，能單獨(dú)給藥；無中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性，不會(huì)誘發(fā)癲癇發(fā)作，能用于細(xì)菌性腦膜炎的治療[1-2]。本試驗(yàn)通過對(duì)注射用比阿培南的單次和多次給藥藥代動(dòng)力學(xué)研究，了解藥物在人體內(nèi)吸收、分布、代謝、排泄的規(guī)律，為該藥制訂合理給藥方案提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1200 LC 高效液相色譜儀（Agilent），Anke TGL-16G 高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），Milli-Q plus超純水器（美國(guó)Millipore公司），XW-80A漩渦混合儀（海門市其林貝爾儀器有限公司）。

1.2 藥品及試劑

注射用比阿培南（四川賽卓藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：080401，含量：91.77%）；5-羥基吲哚乙純（四川賽卓藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：M8150，內(nèi)標(biāo)），甲醇（色譜純），重蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Bonus-RP（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相：甲醇-0.03%醋酸水溶液，流速：1.0 ml/min，進(jìn)樣量：20 μl，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：300 nm，柱溫：35℃，采用梯度洗脫。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取比阿培南對(duì)照品10.00 mg，置于10 ml容量瓶中，用甲醇-水（5∶95，V/V）溶解，并定容至刻度，搖勻，配成1.000 mg/ml比阿培南的儲(chǔ)備液。

2.1.3 血漿樣品處理

精密量取血漿樣品 200 μl，加入內(nèi)標(biāo)溶液 20 μl，旋渦混勻，加入100 μl 7%的ZnSO4水溶液，旋渦3 min，于16000 r/min離心10 min。吸取上清液轉(zhuǎn)移至自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶中，精密吸取10 μl進(jìn)樣，進(jìn)行HPLC分析。

2.1.4 研究對(duì)象

15名男性健康受試者，體重57～68 kg，年齡30～38歲；15名女性健康受試者，體重53～61 kg，年齡29～39歲。30名健康受試者經(jīng)體檢證明肝、腎功能正常，心電圖正常，試驗(yàn)前2周及試驗(yàn)期間未服用其他任何藥物，試驗(yàn)期間統(tǒng)一飲食。

2.1.5 給藥方法

臨床上本品采用的給藥方式為靜脈滴注，故本試驗(yàn)采用將注射用比阿培南，并用100 ml氯化鈉注射液稀釋，靜脈滴注，滴注時(shí)間為1.0 h。根據(jù)說明書，注射用比阿培南的正常臨床治療劑量為靜脈滴注，一次300 mg，12 h一次。故本試驗(yàn)采用低劑量組單次靜脈滴注150 mg；中劑量組單次靜脈滴注300 mg，高劑量組單次靜脈滴注600 mg。多次給藥，每次300 mg，每日2次。

2.1.6 樣品采集

2.1.6.1 單次給藥 受試者于試驗(yàn)前1周和試驗(yàn)期內(nèi)均勿飲用酒類和咖啡類飲料，并在試驗(yàn)開始前一天進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)病房，晚上統(tǒng)一清淡飲食。受試者給藥間隔依取血速度而定，通常間隔5 min。于給藥前0 h、開始給藥后15.0、30.0、45.0、60.0 min，給藥結(jié)束后 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0 h取血；受試者取血順序同給藥順序。受試者服藥后應(yīng)避免劇烈運(yùn)動(dòng)，亦不得長(zhǎng)時(shí)間臥床。

2.1.6.2 多次給藥 中劑量組10名健康受試者在單次給藥結(jié)束后，繼續(xù)進(jìn)行多次給藥，給藥劑量為300 mg/次（藥液稀釋方法同單次給藥），每日2次，連續(xù)給藥5 d，每次靜脈滴注時(shí)間均為1 h（第5天只給藥一次）。 于第2、3、4、5天早給藥前及第 5天開始給藥后15.0、30.0、45.0、60.0 min， 給藥結(jié)束后0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、8.0 h 前臂靜脈取血，每人4 ml，置于肝素試管中，分取血漿，于-20℃保存待測(cè)。受試者服藥后應(yīng)避免劇烈運(yùn)動(dòng)，亦不得長(zhǎng)時(shí)間臥床。多次給藥后3 d對(duì)受試者進(jìn)行體檢復(fù)查。

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 方法專屬性

在本實(shí)驗(yàn)所采用的色譜條件下，注射用比阿培南的保留時(shí)間為3.9 min左右，內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間為9.7 min左右。注射用比阿培南和內(nèi)標(biāo)峰形良好，無雜峰干擾測(cè)定。提示本方法具有較高的特異性，能準(zhǔn)確測(cè)定血漿中的注射用比阿培南的濃度，靈敏度較高。見圖1。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

圖1 血漿中比阿培南的典型色譜

取1.5 ml塑料離心管數(shù)支，量取空白血漿 200 μl，置于離心管中，分別精密加入不同濃度的的比阿培南標(biāo)準(zhǔn)液，旋渦混勻，配成含比阿培南的濃度分別為0.2、0.5、1.0、3.0、10.0、20.0、50.0 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿， 各血漿含 0.1 mg/ml內(nèi)標(biāo)20 μl，按“2.1.3”項(xiàng)下血漿樣品的處理方法操作，制備一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，并同時(shí)做空白樣品，進(jìn)行HPLC-UV分析。記錄色譜圖，計(jì)算比阿培南的峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值f（f=As/Ai）。以峰面積比值f對(duì)血藥濃度C作權(quán)重回歸計(jì)算，得回歸方程：f=0.0019+0.1638C（權(quán)重系數(shù) w=1/C），r=0.9990，按上述條件測(cè)得比阿培南在血漿中的定量下限為0.2 μg/ml。

2.2.3 精密度與準(zhǔn)確度

取1.5 ml塑料離心管數(shù)支，按“2.2.2”血漿中比阿培南標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法制備含比阿培南濃度分別為 0.5、5.0、40.0 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿（每個(gè)濃度做5份樣品）及一條隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，按“2.1.3”項(xiàng)下血漿樣品的處理方法操作。每天做一批及一條隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，連續(xù)做3 d，共3批，每批每個(gè)濃度做5份樣品，記錄色譜圖，計(jì)算比阿培南峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值f，代入當(dāng)天的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得實(shí)測(cè)濃度，計(jì)算批內(nèi)和批間精密度。見表1。

表1 血漿中比阿培南的精密度

2.2.4 加樣回收率試驗(yàn)

取1.5 ml塑料離心管數(shù)支，加入空白血漿0.2 ml，旋渦混勻，配成含比阿培南的濃度分別為0.5、5.0、40.0 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿，計(jì)算比阿培南加樣回收率。見表2。

表2 比阿培南加樣回收率試驗(yàn)（n=5）

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取新鮮配制的比阿培南儲(chǔ)備液和4℃放置4 d的比阿培南儲(chǔ)備液，以甲醇-水（5∶95，V/V）稀釋至 5 μg/ml，各進(jìn)行 3樣本分析，采用HPLC法測(cè)定。內(nèi)標(biāo)（5-羥基吲哚乙酸）儲(chǔ)備液穩(wěn)定性，方法同上，稀釋至10 μg/ml，各進(jìn)行3樣本分析，結(jié)果表明，比阿培南和內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)溶液在4℃存放4 d性質(zhì)穩(wěn)定，RSD分別為1.58%和2.66%，均小于15%。

2.2.6 血藥濃度測(cè)定結(jié)果

30名健康受試者單次靜脈滴注150、300、600 mg后血漿中比阿培南的濃度-時(shí)間曲線。經(jīng)DAS（drug and statistics，Version 2.0）程序處理，用一室模型計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表3，平均血漿藥物濃度-時(shí)間曲線見圖2。

3 討論

據(jù)文獻(xiàn)[3-5]報(bào)道，本品經(jīng)肝臟代謝，經(jīng)尿排泄。本品在體內(nèi)穩(wěn)定，主要以原形藥存在于血和尿中，并通過尿液排泄，其中77%為原形，24 h的尿中回收率為99.3%。因此測(cè)定血漿的比阿培南可以不必考慮到藥物代謝產(chǎn)物的影響。比阿培南作為一種較新開發(fā)的碳青霉烯類抗生素，其血藥濃度測(cè)定方法還有待完善。

圖2 單次和多次靜脈滴注300 mg注射用比阿培南后的平均血藥濃度-時(shí)間曲線比較

表3 健康受試者單次與多次靜脈滴注注射用比阿培南后藥動(dòng)學(xué)參數(shù)比較（，n=10）

表3 健康受試者單次與多次靜脈滴注注射用比阿培南后藥動(dòng)學(xué)參數(shù)比較（，n=10）

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本實(shí)驗(yàn)采用甲醇和0.03%醋酸水溶液為流動(dòng)相，與其他文獻(xiàn)中使用C18柱相比，本實(shí)驗(yàn)中使用的是水性柱，通過HPLC法測(cè)定人血漿中比阿培南的濃度，可以使藥品比阿培南和內(nèi)標(biāo)出峰迅速，靈敏度高。在該HPLC的檢測(cè)條件下，血樣的最低檢測(cè)濃度可以達(dá)到0.2 μg/ml，可顯著降低樣品的測(cè)定體積，減少取樣量，對(duì)進(jìn)一步臨床試驗(yàn)具有重要意義。本試驗(yàn)建立的人血漿中比阿培南的HPLC測(cè)定方法，其特異性、標(biāo)準(zhǔn)曲線、定量限、精密度、準(zhǔn)確度及樣品穩(wěn)定性等均符合《化學(xué)藥物臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》的相關(guān)要求，適用于比阿培南藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)的研究。

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