王慧敏 陳杭薇 尤蘭華 李雪輝 魏 娟 石偉先

流行性感冒(influenza，F(xiàn)lu)由流感病毒所致，具病毒核蛋白(nucleoprotein，NP)和基質(zhì)蛋白(matrix protein，M)的特征，流感病毒分為甲、乙和丙型。其中最常見、毒力大的是甲型流感病毒(influenza A，F(xiàn)luA)［1］。2009年4月從墨西哥開始流行的新型甲型H1N1流感引起全球重視。為了探討FluA臨床可靠、快速、便捷的檢測方法，我們應(yīng)用膠體金免疫層析法(gold immunochromatography assay，GICA)對流感樣癥狀患者鼻咽部分泌物做快速檢測，并用雙份血清血凝抑制(hemagglutination inhibition，HI)抗體做對比。現(xiàn)報道如下。

對象和方法

一、觀察對象

收集2009年9月16日至2010年2月1日住北京軍區(qū)總醫(yī)院呼吸內(nèi)科的115例急性呼吸道感染患者，其中男72例，女43例，年齡(60.10±21.97)歲。病種包括急性上呼吸道感染、急性支氣管炎、肺炎、支氣管哮喘及慢性肺源性心臟病等，未接種過流感疫苗。

二、標(biāo)本采集

入院當(dāng)日或次日凌晨，采集患者鼻咽部分泌物鼻咽拭子現(xiàn)場做GICA快速檢測，同時采集急性期與恢復(fù)期雙份血清(各1 mL，間隔時間為3～17天)，離心置于EP管中，4℃條件下24 h內(nèi)轉(zhuǎn)置-20℃保存。凍存的115例雙份血清標(biāo)本4℃條件下集中分次送至北京市疾病預(yù)防控制中心實驗室，24 h內(nèi)進(jìn)行血凝抑制試驗檢測FluA(新型H1N1、季節(jié)性H1H1和季節(jié)性H3N2)三種HIAb亞型。以上試驗均獲醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

三、研究方法

1.GICA結(jié)果

采用阿斯可來生物工程有限公司，F(xiàn)luA型(國藥準(zhǔn)字S20063095)，有效期內(nèi)使用。本試劑盒原理:檢測試紙上預(yù)先固定抗甲型流感病毒核心蛋白單克隆抗體，及膠體金標(biāo)記有另一株抗甲型流感病毒核心抗原單克隆抗體，建立的雙抗夾心免疫學(xué)檢測方法(不能檢測FluA亞型)。

分別取患者鼻咽分泌物拭子置于盛有10滴稀釋液的塑料管中，充分?jǐn)D壓，使分泌物充分溶于稀釋液中，將鼻咽拭子盡量擰干取出;再取溶有患者鼻咽分泌物的稀釋液滴入FluA檢測試紙卡加樣孔中四滴，使試紙充分浸濕，15 min觀察結(jié)果:出現(xiàn)兩條顯色帶者為陽性，一條顯色帶者為陰性。GICA法檢測結(jié)果，見圖1。

圖1 GICA法檢測結(jié)果直觀圖Figure 1 The Pictorial diagram of inspection results by GICA method

2.HI結(jié)果

用HI法檢測FluA(新型H1N1、季節(jié)性H1H1和季節(jié)性H3N2)三種HIAb亞型。抗原病毒株(流感病毒抗原A1/天津津南/15/2009、A/SiChuan/SW1/2009、A3/福建同安/196/2009)及HI法所需材料均由北京市疾病預(yù)防控制中心提供。試驗結(jié)果以抗體效價≥1∶40視為有保護(hù)性［2］，雙份血清抗體水平≥4倍增高作為陽性(金標(biāo)準(zhǔn))，抗體水平＜1∶10者，均以1∶5替代。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包，制作2×2列聯(lián)表，求Kappa值，對兩種方法做一致性檢驗，并進(jìn)行配對設(shè)計χ2檢驗，計算GICA法的敏感度、特異度、Youden指數(shù)等。對計數(shù)資料進(jìn)行χ2檢驗。

結(jié) 果

一、GICA法

115例流感樣癥狀患者鼻咽拭子標(biāo)本進(jìn)行FluA的GICA法快速檢測，陽性為21例，陽性率18.3%(21/115)。陽性結(jié)果病種分布及檢出時間，見表1。

二、HI法

1.年齡和病種分布

115例雙份血清標(biāo)本HI抗體滴度≥4倍增高者共22例，＜65歲者占到7/22，≥65歲者占15/22。其中13例為肺炎(其中重癥肺炎9例，雙側(cè)肺炎3例，間質(zhì)性肺炎1例)，5例為肺心病，1例肺癌，1例支氣管擴(kuò)張癥，1例肺結(jié)核，1例急性咽峽炎。

2.亞型和時間分布

FluA(新型H1N1)檢出率為4.3%(5/115)，F(xiàn)luA(季節(jié)性H1N1)檢出率為2.6%(3/115)，F(xiàn)luA(季節(jié)性H3N2)檢出率為6.1%(7/115)，F(xiàn)luA混合感染檢出率為6.1%(7/115)。HI法檢測FluA亞型及時間分布，見表2。

三、GICA法與HI法比較

1.兩種方法檢測結(jié)果分析

115例患者同時做FluA抗原GICA法快速檢測與雙份血清抗體檢測，兩種方法的檢出結(jié)果(見表2)行McNemar χ2檢驗，P=1.000，說明兩種方法的陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。兩種方法一致性檢驗結(jié)果:Kappa系數(shù)為0.628，P=0.000，兩種檢測方法的吻合程度具有統(tǒng)計學(xué)意義。但通常Kappa系數(shù)值大于0.7說明吻合程度比較好。FluA的兩種檢測方法檢測結(jié)果，見表3。

表1 GICA法檢測FluA結(jié)果陽性標(biāo)本的采集時間及病種分布Table 1 The entity distribution and gather time of FluA positive cases detected by GICA onethod

表2 HI法檢測FluA亞型及時間分布Table 2 The FluA subtype and time distribution detcted by HI method

表3 FluA的兩種檢測方法檢測結(jié)果Table 3 The typical values of two test methods of FluA

2.篩檢試驗評價指標(biāo)及篩檢結(jié)果臨床意義估計

以檢測FluA的HI法作為金標(biāo)準(zhǔn)，對GICA法進(jìn)行評價，檢測FluA的特異性93.5%，敏感性68.2%，誤診率 6.5%，漏診率 31.8%，約登指數(shù) 0.617，符合率 84.3%。

討 論

20世紀(jì)以來人類遭受了4次FluA大流行，致使數(shù)千萬人喪命。100多年以來人類遭受了4次FluA大流行，致使數(shù)千萬人喪命。第一次大流行發(fā)生于1918年至1919年，稱為“西班牙流感”(Spanish influenza)，被認(rèn)為是人類有史以來最大的一次浩劫，患病人數(shù)在5億以上，導(dǎo)致4000多萬人死亡，而且死亡病例多為青壯年。20世紀(jì)30年代末，對1918年流感大流行幸存者的血清進(jìn)行抗體檢測，證實1918年流行的毒株是H1N1病毒［3］。第二次大流行發(fā)生于1957年，稱為“亞洲流感”(Asian influenza)，最早出現(xiàn)于中國西南部，由H2N2亞型病毒引起，這一亞型后被證實由人H1N1亞型流感病毒與禽源流感病毒3個基因片段重組而來，死亡病例多發(fā)生在兒童和老年人［4］。第三次大流行發(fā)生于1968年，稱為“香港流感”(Hong Kong influenza)，由H3N2亞型病毒引起，該病毒在中國香港首次分離，該病毒的HA和PB1兩個基因節(jié)段來自禽流感病毒，其他六個基因節(jié)段來自當(dāng)時流行于人群的 H2N2病毒［5］。第四次大流行發(fā)生于1977年，稱為“俄羅斯流感”(Russian influenza)，由H1N1亞型引起，該流感最早是在我國丹東、鞍山和天津等地區(qū)暴發(fā)，該病毒主要侵襲25歲以下青年人和中小學(xué)生［6］。

2009年4月，一種先前未曾報道的毒株從墨西哥人感染病例中被分離出并鑒定為新型甲型H1N1流感病毒株，這種病毒隨后波及超過90個國家［7-10］。

隨著抗流感病毒特效藥“鹽酸奧斯他韋”的面世，在流感的早期診斷和治療上對廣大臨床醫(yī)生提出了新的要求。要早期確診流感除了臨床癥狀之外必須輔以病毒的試驗室檢測結(jié)果。細(xì)胞培養(yǎng)方法、PCR法和血清學(xué)檢測中的血凝抑制試驗?zāi)壳肮J(rèn)為確診流感病毒感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但以上方法費時費力，技術(shù)條件要求高不適用于基層醫(yī)院;檢測雙份血清的血凝抑制試驗屬于回顧性研究，結(jié)果滯后，在臨床診斷上沒有應(yīng)用價值。流感的診治通常依靠醫(yī)生的臨床經(jīng)驗，容易造成誤診和濫用抗生素。

以膜為固相載體的膠體金快速診斷技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種體外診斷技術(shù)，由于其快速、便捷、結(jié)果判斷直觀使其在醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域得到了迅猛的發(fā)展，也開始應(yīng)用于流感臨床初步診斷。臨床醫(yī)師依據(jù)檢測結(jié)果能及時判斷患者是否感染了流感病毒，從而盡早開展針對性的治療，對控制流感的擴(kuò)散，減少疾病造成的危害以及抗生素濫用具有重要的意義。

GICA法與雙份血清抗體法相比，二者一致性較好。如果一位發(fā)熱患者GICA法被檢測FluA抗原陽性，同時患者雙份血清FluA特異性抗體又達(dá)到4倍增高，則可認(rèn)為此次FluA即為患者此次發(fā)病的致病原，而非上呼吸道的定植病毒。

2009年10月以來，北半球已經(jīng)進(jìn)入秋冬季，美國、日本、歐洲各國、中國等地甲型H1N1流感活動呈快速上升趨勢，流行高峰較往年提前2個月左右，并持續(xù)快速上升，流行強(qiáng)度超過往年季節(jié)性流感的秋冬季流行高峰，2009年12月開始下降［11］。本項研究中GICA法和HI法檢測FluA，陽性結(jié)果主要出現(xiàn)在2009年9月至12月，符合FluA的這一流行趨勢。病種上集中在肺炎和慢性肺源性心臟病患者組，與國家衛(wèi)生部頒布的甲流診斷標(biāo)準(zhǔn)［12］中提到慢性呼吸系統(tǒng)疾病者為高危人群是符合的。2009年FluA感染中FluA(新型H1N1)亞型檢出例數(shù)最多，符合新型甲型H1N1病毒為2009年度流行株的趨勢。而FluA(季節(jié)性H1N1、H3N2)也有檢出，提示季節(jié)性甲型流感散發(fā)流行是不容忽視的。2010年同期，F(xiàn)luA(新型H1N1)以混合感染形式與FluA(H1N1)和(或)FluA(H3N2)散發(fā)存在。這與WHO 2010年8月10日在日內(nèi)瓦召開會議宣布世界現(xiàn)已處在流感大流行后期并預(yù)計2009年H1N1流感病毒會在未來數(shù)年內(nèi)以季節(jié)性病毒的方式繼續(xù)傳播相符合。

1 李 剛.甲型H1N1流感病毒的分子特征［J］.首都醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009，30(3):267-270.LI Gang.Molecular characteristics of A(H1N1)influenza virus［J］.J Cap Univ Med Sci，2009，30(3):267-270.

2 湯奮揚，祖榮強(qiáng)，李 亮，等.江蘇省2009年3歲以上自然人群新甲型H1N1流感血清流行病學(xué)調(diào)查［J］.中華流行病學(xué)雜志，2010，31(5):489-493.TANG Fen-yang，ZU Rong-qiang，LI Liang，et al.Serologic survey on pandemic influenza A(H1N1)virus among aged ≥3 years population from Jiangsu province in 2009，China［J］.Chin J Epidem，2010，31(5):489-493.

3 徐翠玲，楊 磊，溫樂英.1918年流感大流行的流行病學(xué)概述［J］.病毒學(xué)報，2009，25(B05):23-26.XU Cui-lin，YANG Lei，WEN Le-ying.The overview of epidemiology of influenza pandemic in1918［J］.Chin J Vir，2009，25(B05):23-26.

4 隋竑弢，楊麗梅，王 偉.1957年流感大流行的流行病學(xué)概述［J］.病毒學(xué)報，2009，25(B05):27-32.SUI Hong-tao，YANG Li-mei，WANG Wei.The overview of epidemiology of influenza pandemic in 1957［J］.Chin J Vir，2009，25(B05):27-32.

5 袁 帆，藍(lán) 雨，郭俊峰.1968年流感大流行的流行病學(xué)概述［J］.病毒學(xué)報，2009，25(B05):33-35.YUAN Fan，LAN Yu，GUO Jun-feng.The overview of epidemiology of influenza pandemic in 1968［J］.Chin J Vir，2009，25(B05):33-35.

6 高 燕，孫閃華，劉 微.1977年流感大流行的流行病學(xué)概述.病毒學(xué)報，2009，25(B05):21-22.GAO Yan，SUN San-hua，LIU Wei.The overview of epidemiology of influenza pandemic in1977［J］.Chin J Vir，2009，25(B05):21-22.

7 周 凱，何宏軒.禽流感與豬流感病毒:跨越物種傳播的新認(rèn)識［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2009，36(5):523-529.ZHOU Kai，HE Hong-Xuan.Avian influenza and swine influenza:new understanding of crossing species barrier［J］.Prog Biochem Biophys，2009，36(5):523-529.

8 Dawood F S，Jain S，F(xiàn)inelli L，et al.Emergence of a novel swine-origin influenza A(H1N1)virus in humans［J］.New Eng J Med，2009，360(25):2605-2615.

9 Smith GJ，Vijaykrishna D，Bahl J，et al.Origins and evolutionary genomics of the 2009 swine-origin H1N1 influenza A epidemic［J］.Nature，2009，459(7250):1122-1125.

10 Trifonov V，Khiabanian H，Greenbaum B，et al.The origin of the recent swine influenza A(H1N1)virus infecting humans［J］.Euro Surveill，2009，14(17):948.

11 何劍峰，張正敏.新甲型H1N1流感與流感大流行［J］.華南預(yù)防醫(yī)學(xué)2010，36(1):73-75.HE Jian-feng，ZHANG Zheng-min.New A(H1N1)influenza and influenza pandemic［J］.South Chin J Prevent Med，2010，36(1):73-75.

12 鐘南山，李蘭娟，王 晨，等.甲型H1N1流感診療方案(2009年第二版).中華醫(yī)學(xué)雜志，2009，89:2526-2528.ZHONG Nan-shan.LI Lan-juan，WANG Chen，et al.Diagnostic protocol of influenza A(H1N1)(20092th)［J］.Med J Chin，2009，89:2526-2528.