李凌凌，呂早生，李 濤，沈 輝

(武漢科技大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430081)

聚酮化合物，是廣泛存在于自然界中的結(jié)構(gòu)多樣的次生代謝產(chǎn)物，具有很大的醫(yī)藥應(yīng)用價(jià)值，包括很多抗生素和抗真菌藥。聚酮是由聚酮合成酶(Polyketide synthase，PKS)催化一系列的小分子前體進(jìn)行重復(fù)縮合反應(yīng)而合成的。目前為止，至少有3種不同類型的聚酮合成酶[1]，其中Ⅰ型聚酮合成酶是一種模塊型的多功能酶，如負(fù)責(zé)催化合成紅霉素A中大環(huán)內(nèi)酯環(huán)的6-脫氧紅霉內(nèi)酯B合成酶(6-Deoxyerythronolide B synthase，DEBS)，DEBS有6套結(jié)構(gòu)和功能相近的模塊，每套模塊催化完成一輪碳鏈的延伸和還原，其上有酮合成酶(Ketosynthase，KS)、?；D(zhuǎn)移酶(Acyl transferase，AT)和?；d體蛋白(Acyl carrier protein，AC)3個(gè)基本酶域，且可能含有酮還原酶(Ketoreductase，KR)、脫水酶(Dehydratase，DH)和烯醇還原酶(Enoyl reductase，ER)[2]。Ⅱ型聚酮合成酶是一種可重復(fù)催化反應(yīng)的多酶復(fù)合體，負(fù)責(zé)合成芳香族聚酮，如放線菌素。聚酮合成酶中的酮還原酶屬于短鏈脫氫酶(Short-chain dehydrogenase/reductase，SDR)超家族。2004年，Korman等[3]和Hadfield等[4]通過比較芳香族聚酮的酮還原酶與其它短鏈脫氫酶超家族成員的結(jié)構(gòu)差異，提出芳香族聚酮的酮還原酶(如放線菌素聚酮還原酶ActKR)與其它SDR家族成員的差異為α6和α7間的10個(gè)氨基酸殘基，該區(qū)域是SDR家族的底物結(jié)合口袋的一部分，是最不保守的序列，負(fù)責(zé)控制底物特異性。2006年，Keatinge-Clay等[5]研究了糖多孢紅霉菌聚酮合成酶模塊1的酮還原酶域EryKR1的結(jié)構(gòu)，提出了該酶域與其它酶域間的界限、多聚體的組成方式以及控制催化立體選擇性還原反應(yīng)的機(jī)制等，但未提及該酶域的底物結(jié)合口袋等。同年Bali等[6]在大腸桿菌中異源表達(dá)了糖多孢紅霉菌聚酮合成酶的酮還原酶域，并研究了該酶域的底物特異性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此酶域?qū)Y(jié)構(gòu)中含有環(huán)己酮的底物都有活性，但該研究并沒有以這些底物進(jìn)行生物催化，得出有關(guān)轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率的數(shù)據(jù)。

作者在此通過比對(duì)EryKR1酶域和ActKR酶的氨基酸序列和二維結(jié)構(gòu)，根據(jù)ActKR中控制底物特異性位點(diǎn)為α6和α7間的10個(gè)氨基酸殘基EHYSDIWEVS，推測(cè)EryKR1酶域中控制底物特異性位點(diǎn)的氨基酸殘基，接著利用重疊PCR技術(shù)，擴(kuò)增出推測(cè)的控制底物特異性位點(diǎn)的氨基酸序列，替換成ActKR對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的EHYSDIWEVS的突變型EryKR1酶域基因eryKR1M，將此DNA片段克隆到pET-28a上，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-eryKR1M，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，且研究由此獲得的重組菌株與野生型重組菌E.coliBL21(pET-eryKR1)2在針對(duì)環(huán)己酮、2-辛酮、苯乙酮和4-氯乙酰乙酸乙酯進(jìn)行生物催化羰基還原上的區(qū)別，旨在研究EryKR1酶域中α6和α7間的氨基酸殘基替換對(duì)上述底物催化特異性的改變情況，進(jìn)而分析探討EryKR1酶域的底物特異性位點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

糖多孢紅霉菌A226(SaccharopolysporaerythraeaA226)、大腸桿菌BL21、DH5α及表達(dá)載體pET-28a由安徽大學(xué)張部昌教授惠贈(zèng)；E.coliBL21 (pET-gdh1)菌株(即異源表達(dá)枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶基因gdh的大腸桿菌重組菌)以及E.coliBL21 (pET-eryKR1)2菌株(即異源表達(dá)野生型EryKR1酶域基因eryKR1的大腸桿菌重組菌)均為自行構(gòu)建保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基按照文獻(xiàn)[7]配制，篩選抗性菌株時(shí)，加終濃度100 μg·mL-1的卡拉霉素；TSB培養(yǎng)基(%)：Tryptic Soy Broth 3 g，用于S.erythraea的液體培養(yǎng)[8]。

1.1.3 工具酶和化學(xué)試劑

限制性核酸內(nèi)切酶、蛋白酶K、RNase酶、T4DNA連接酶、IPTG，Takara公司；DNA純化和質(zhì)粒少量快速提取試劑盒，北京道普生物技術(shù)開發(fā)中心；dNTP、pfu DNA聚合酶，北京天為時(shí)代生物技術(shù)有限公司；引物合成和測(cè)序工作由上海生工公司完成；Tryptic Soy Broth，F(xiàn)ulka；4-氯乙酰乙酸乙酯(97%)，Alfa Aesar；R-4-氯-3-羥基丁酸乙酯(98%)，AcRos；其它試劑均為國產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1eryKR1M基因的克隆及表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

糖多孢紅霉菌A226基因組DNA的提取參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。根據(jù)文獻(xiàn)[5]報(bào)道的EryKR1酶域的邊界，設(shè)計(jì)擴(kuò)增突變型eryKR1M基因的兩端引物，為便于克隆，在正向引物和反向引物前分別加上NdeⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)，引物L(fēng)KR：5′-gccatatggacgaggtttccgcgctgcg-3′(gc為保護(hù)性堿基，catatg為NdeⅠ酶切位點(diǎn))，引物RKR：5′-gcggatcctcacgcgcccacccgcggttcggc-3′(gc為保護(hù)性堿基，ggatcc為BamHⅠ酶切位點(diǎn))；用于擴(kuò)增中間突變位點(diǎn)的重疊PCR引物：引物ActKRL：5′-gagcactactcggacatctgggaggtgtcgcccgagac-ggcctgccgggc-3′，引物ActKRR：5′-cgacacctcccagatgtcggagtgctcgcggaagcggtcggccaccg-3′；PCR擴(kuò)增體系和條件見文獻(xiàn)[9]。獲得的PCR特異片段產(chǎn)物回收純化后，經(jīng)上海生工測(cè)序部測(cè)序，再利用NCBI的Nucleotide blast(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)[10]進(jìn)行比對(duì)，以確認(rèn)是否為對(duì)應(yīng)位點(diǎn)發(fā)生所需突變的目標(biāo)基因。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、載體的雙酶切及連接、大腸桿菌轉(zhuǎn)化等分子操作，參照文獻(xiàn)[7]按常規(guī)方法進(jìn)行；PCR產(chǎn)物及雙酶切產(chǎn)物的回收純化和質(zhì)粒小量提取按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

1.2.2 酶的誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE分析

將E.coliBL21(pET-eryKR1M)重組菌按1%的接種量接入到含有100 μg·mL-1卡拉霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至A600=1.0，加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG，37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h后，4000 r·min-1、4 ℃離心10 min，收集菌體，將收集的菌體進(jìn)行SDS-PAGE分析，以檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)量[11]。

1.2.3 重組菌催化還原羰基底物的反應(yīng)

雙重組菌耦合還原4種羰基底物(環(huán)己酮、2-辛酮、苯乙酮和4-氯乙酰乙酸乙酯)的反應(yīng)體系參照文獻(xiàn)[12]。上述轉(zhuǎn)化體系于30 ℃、100 r·min-1振蕩反應(yīng)6 h后，6000 r·min-1離心10 min，收集上清。氣相色譜檢驗(yàn)乙酸乙酯萃取轉(zhuǎn)化液上清獲得的有機(jī)相，用于分析產(chǎn)物得率。分析環(huán)己酮、苯乙酮、4-氯乙酰乙酸乙酯及2-辛酮轉(zhuǎn)化液的氣相色譜條件參照文獻(xiàn)[12]。還原反應(yīng)的產(chǎn)率按文獻(xiàn)[11]計(jì)算。

1.2.4 序列分析

采用DNAssist軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)的氨基酸序列比對(duì)，采用PSIPRED Server進(jìn)行蛋白質(zhì)的二維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)，采用Swiss-model進(jìn)行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(http://swissmodel.expasy.org/)，以了解突變對(duì)酶的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 對(duì)EryKR1酶域的序列分析

根據(jù)Hadfield等的報(bào)道，放線菌素聚酮還原酶ActKR的底物結(jié)合口袋是由β4、β5和β6折疊的羧基端和α5的氨基端以及α6-環(huán)-α7形成，且α6和α7之間的10個(gè)氨基酸殘基是芳香族聚酮還原酶(如ActKR)和其它SDR家族成員最大的差異，決定了SDR家族成員的不同的底物特異性[4]。因此利用DNAssist軟件和PSIPRED Server對(duì)EryKR1酶域和放線菌素聚酮還原酶ActKR分別進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)(如圖1所示)和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(如圖2所示)，發(fā)現(xiàn)EryKR1酶域的二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖2b)基本符合ActKR酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖2a)的模式特點(diǎn)，推測(cè)EryKR1的底物結(jié)合口袋也由α6-環(huán)-α7組成，且其中的氨基酸殘基RHGVIEMP對(duì)應(yīng)于放線菌素聚酮還原酶的α6和α7之間的10個(gè)氨基酸殘基EHYSDIWEVS，可能決定了EryKR1酶域和ActKR酶的不同的底物特異性。

框中為α6-環(huán)-α7間的氨基酸殘基，黑色標(biāo)記是相同殘基，灰色標(biāo)記是相似殘基

圖2 PSIPRED Server進(jìn)行的二維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(方框中為α6-環(huán)-α7間的氨基酸殘基)

2.2 pET-eryKR1M重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

以糖多孢紅霉菌基因組DNA為模板，以引物L(fēng)KR和ActKRR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物eryKR1M-L，再以引物RKR和ActKRL進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物eryKR1M-R，將這些PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行1.0%和2.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖3所示。

1、3、5分別為eryKR1M-L、eryKR1M-R、eryKR1M的PCR回收純化產(chǎn)物 2、4、6為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

由圖3a、3b可見，PCR產(chǎn)物eryKR1M-L位于1000～2000 bp之間，與目標(biāo)基因突變位點(diǎn)左側(cè)的序列長度(1250 bp)吻合，而片段eryKR1M-R位于200～300 bp之間，與目標(biāo)基因突變位點(diǎn)右側(cè)的序列長度(210 bp)吻合。以片段eryKR1M-L和eryKR1M-R(體積比為3∶1)為模板，再以引物L(fēng)KR和RKR進(jìn)行擴(kuò)增，利用重疊PCR獲得產(chǎn)物eryKR1M，以1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳(圖3c)，片段大小位于1000～2000 bp之間，與目標(biāo)基因的序列長度(1450 bp)吻合。將eryKR1M片段克隆到pET-28a載體上，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-eryKR1M。對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定(圖4)，證實(shí)了質(zhì)粒pET-eryKR1M中克隆的基因片段與目標(biāo)片段的大小一致。

1.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 2.pET-eryKR1M重組質(zhì)粒經(jīng)NdeⅠ和Bam HⅠ雙酶切產(chǎn)物

利用NCBI提供的核苷酸比對(duì)功能，對(duì)重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列分析，得出測(cè)序結(jié)果與登錄號(hào)為AY661566.1報(bào)道的糖多孢紅霉菌聚酮合成酶基因簇(總長為32 299 bp)中4384～5756 bp之間的堿基序列的相似度達(dá)到99%，其中AY661566.1序列中的第5572～5595個(gè)堿基aggcacggcgtcatcgagatgcct(編碼的氨基酸序列為RHGVIEMP)已替換成測(cè)序結(jié)果中的gagcactactcggacatctgggaggtgtcg(編碼的氨基酸序列為EHYSDIWEVS)，如圖5所示。說明野生型eryKR1基因中編碼α6-環(huán)-α7之間的氨基酸殘基RHGVIEMP的堿基序列已突變成了放線菌素聚酮還原酶對(duì)應(yīng)位點(diǎn)EHYSDIWEVS相應(yīng)的堿基序列。

圖5 pET-eryKR1M測(cè)序結(jié)果的核苷酸比對(duì)分析(方框標(biāo)記的是突變位點(diǎn))

2.3 突變型eryKR1M基因的誘導(dǎo)表達(dá)

表達(dá)載體pET-eryKR1M轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)后，獲得了E.coliBL21 (pET-eryKR1M)重組菌，以E.coliBL21 (pET-28a)菌為陰性對(duì)照，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖6。

1、3、4分別為IPTG誘導(dǎo)的E.coli BL21(pET-28a)、E.coli BL21(pET-eryKR1)2、E.coli BL21(pET-eryKR1M)的全蛋白 2.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)

由圖6可知，經(jīng)誘導(dǎo)的E.coliBL21(pET-eryKR1M)中表達(dá)的蛋白質(zhì)條帶和陰性對(duì)照的相比，存在明顯的差異，重組菌在45.0～62.0 ku之間有明顯的突變的酮還原酶域表達(dá)條帶(相對(duì)分子量為57 ku，包括了pET-28a載體表達(dá)的His tag片段)。利用BandScan 5.0軟件分析目標(biāo)蛋白的SDS-PAGE掃描圖片，其中E.coliBL21 (pET-eryKR1M)重組菌中目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)量占全菌可溶性蛋白質(zhì)的5.7%，與異源表達(dá)野生型eryKR1基因的E.coliBL21(pET-eryKR1)2中EryKR1酶域的表達(dá)量5.89%基本一致。

2.4 E.coli BL21(pET-eryKR1M)催化還原4種羰基底物

E.coliBL21(pET-eryKR1M)和E.coliBL21 (pET-eryKR1)2重組菌以環(huán)己酮、2-辛酮、4-氯乙酰乙酸乙酯和苯乙酮分別為底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，以E.coliBL21(pET-28a)針對(duì)這些底物的轉(zhuǎn)化液作為陰性對(duì)照進(jìn)行氣相色譜檢測(cè)，結(jié)果見表1。野生型和突變型重組菌以環(huán)己酮為底物的轉(zhuǎn)化液的氣相色譜見圖7。

a.E.coli BL21(pET-eryKR1)2還原環(huán)己酮轉(zhuǎn)化液 b.E.coli BL21(pET-eryKR1M)還原環(huán)己酮轉(zhuǎn)化液

表1 重組菌E.coli BL21(pET-eryKR1M)對(duì)4種底物的轉(zhuǎn)化液的氣相色譜檢測(cè)結(jié)果

由表1和圖7可知，E.coliBL21 (pET-eryKR1M)重組菌不能還原環(huán)己酮，而野生型重組菌E.coliBL21(pET-eryKR1)2卻可還原環(huán)己酮產(chǎn)生環(huán)己醇，產(chǎn)率可達(dá)93.24%，且兩種重組菌對(duì)其它底物幾乎沒有還原作用。這說明EryKR1酶域中α6和α7間的氨基酸定點(diǎn)突變之后，確實(shí)會(huì)影響酶域與底物環(huán)己酮的結(jié)合，使得酶域不能催化還原環(huán)己酮，但酶域也沒有因此突變，而改變對(duì)其它底物的催化特異性。

利用Swiss-model對(duì)RHGVIEMP殘基替換成ActKR對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的氨基酸殘基EHYSDIWEVS的突變型EryKR1酶域的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，對(duì)比突變前后EryKR1的三維結(jié)構(gòu)(如圖8所示)，發(fā)現(xiàn)EryKR1酶域中α6和α7之間的氨基酸突變后(圖8a)，與野生型酶域(圖8b)相比，該區(qū)域伸出了空間之外，這樣一個(gè)突變，可能造成不同結(jié)構(gòu)的底物不能正常進(jìn)入到酶活性中心，進(jìn)而不能發(fā)生催化反應(yīng)。

圖8 突變型EryKR1酶域與野生型EryKR1的空間結(jié)構(gòu)比對(duì)

2.5 討論

在細(xì)胞正常的新陳代謝活動(dòng)中，大多數(shù)的反應(yīng)如糖代謝、類固醇生物合成等，都能產(chǎn)生醛或酮中間產(chǎn)物。這些含酮和醛的化合物是很強(qiáng)的突變劑，在生物體中，存在很多酶可代謝這些中間產(chǎn)物，如短鏈脫氫酶/還原酶家族和醛酮還原酶超家族(Aldo-keto reductase，AKR)等，都可以將羰基還原成相應(yīng)醇[13]。短鏈脫氫酶/還原酶家族是氧化還原酶超家族之一，該家族大約有3000個(gè)成員，作用的底物廣泛，包括乙醇、糖、類固醇、芳香族化合物等。SDRs家族成員雖然一級(jí)序列只有15%～30%的同源性，但是三級(jí)結(jié)構(gòu)卻有著高度的相似性[14](除了羧基端有較大的差異)，均形成典型的Rossman折疊，具有很多保守的氨基酸序列。放線菌素聚酮還原酶ActKR和糖多孢紅霉菌聚酮合成酶的酮還原酶域均屬于SDR超家族[4，5]。

2004年，Korman等和Hadfield等提出芳香族聚酮還原酶和其它SDR家族成員最大的差異是α6和α7間的10個(gè)氨基酸殘基，而這個(gè)區(qū)域?yàn)榈孜锝Y(jié)合口袋的一部分，是SDR家族中最不保守的區(qū)域，決定了SDR家族成員的不同的底物特異性[3，4]。本研究根據(jù)ActKR和EryKR1的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果和預(yù)測(cè)的二維結(jié)構(gòu)比較結(jié)果，推測(cè)EryKR1酶域中的α6和α7之間的氨基酸序列RHGVIEMP也為底物結(jié)合口袋中的一部分，決定了該酶域的底物特異性。并利用重疊PCR技術(shù)，將eryKR1基因中編碼該區(qū)域的堿基替換成編碼ActKR中對(duì)應(yīng)序列EHYSDIWEVS的相應(yīng)堿基，并構(gòu)建了異源表達(dá)該突變型eryKR1基因(即eryKR1M基因)的重組菌E.coliBL21(pET-eryKR1M)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與野生型重組菌株E.coliBL21(pET-eryKR1)2相比，突變型重組菌不能還原環(huán)己酮，且對(duì)于其它類型的羰基底物，也沒有因突變而產(chǎn)生還原能力，說明該區(qū)域的突變使得原來的底物環(huán)己酮不能進(jìn)入到酶的活性中心，且盡管替換成芳香族酮還原酶的對(duì)應(yīng)位點(diǎn)，也不能因此使芳香族底物苯乙酮進(jìn)入到酶的活性中心，說明該區(qū)域雖然控制底物特異性，但仍需要和其它底物結(jié)合位點(diǎn)相互配合，才能使底物進(jìn)入酶的活性中心，進(jìn)而發(fā)生催化還原反應(yīng)。由此可見，如果想通過定點(diǎn)突變改變EryKR1的底物特異性，除了該區(qū)域的突變，可能還需要其它的底物結(jié)合位點(diǎn)的突變進(jìn)行配合。

3 結(jié)論

為驗(yàn)證糖多孢紅霉菌聚酮合成酶模塊1的酮還原酶域EryKR1中的控制底物特異性位點(diǎn)，以糖多孢紅霉菌基因組DNA為模板，用重疊PCR技術(shù)擴(kuò)增出α6和α7之間的氨基酸殘基RHGVIEMP對(duì)應(yīng)的核苷酸序列被替換的EryKR1酶域DNA片段eryKR1M，并克隆到表達(dá)載體pET-28a上，構(gòu)建了質(zhì)粒pET-eryKR1M，轉(zhuǎn)化到EscherichiacoliBL21(DE3)后，獲得了重組菌株E.coliBL21(pET-eryKR1M)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE電泳分析表明重組大腸桿菌E.coliBL21(pET-eryKR1M)中的重組蛋白質(zhì)表達(dá)量占全菌胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)的5.7%。E.coliBL21 (pET-eryKR1M)和異源表達(dá)枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶基因的重組菌E.coliBL21 (pET-gdh1)進(jìn)行雙重組菌耦合，對(duì)4-氯乙酰乙酸乙酯、苯乙酮、2-辛酮和環(huán)己酮4種底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化還原，利用氣相色譜分析轉(zhuǎn)化液，結(jié)果顯示突變型的重組菌E.coliBL21(pET-eryKR1M)失去野生型重組菌E.coliBL21 (pET-eryKR1)2還原環(huán)己酮的能力，結(jié)合EryKR1酶域與放線菌素聚酮還原酶ActKR的氨基酸序列比對(duì)和二維結(jié)構(gòu)比較的結(jié)果，推測(cè)α6和α7間氨基酸殘基RHGVIEMP為EryKR1酶域中的底物結(jié)合口袋組成單元，對(duì)酶活性保持非常重要。

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