鄭文燕，王曉東，彭 維，沈 藝，蘇薇薇

(1.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275；2.廣州市花城制藥廠(chǎng)，廣東 廣州 510555)

祛痰止咳顆粒是廣州市花城制藥廠(chǎng)獨(dú)家生產(chǎn)的國(guó)家中藥保護(hù)品種，具有健脾燥濕、祛痰止咳的功效；主要用于慢性支氣管炎及支氣管炎合并肺氣腫、肺心病所引起的痰多，咳嗽，喘息等癥。該顆粒是由《傷寒論》和《金匱要略》中的參夏湯與十棗湯化裁而來(lái)[1]，主要由紫花杜鵑、黨參、芫花、甘遂、水半夏五味藥材組成。筆者首次建立了祛痰止咳顆粒的指紋圖譜質(zhì)量控制方法，解決原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)無(wú)法全面控制該產(chǎn)品質(zhì)量的瓶頸問(wèn)題，并將該項(xiàng)指紋圖譜技術(shù)應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐，監(jiān)控成品質(zhì)量。

1 儀器與試藥

Dionex P680高效液相色譜儀(美國(guó)戴安公司，ASI-100自動(dòng)進(jìn)樣器、ATH-585柱溫箱、四元梯度泵、PDA-100檢測(cè)器)及Chromeleon工作站；Agilent高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 1200RRLC-6410三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀)；BP211D電子分析天平(瑞士沙多利斯公司)；T660/H超聲波清洗器(美國(guó)?，敼?。

金絲桃苷(批號(hào)：111521-200303)、槲皮苷(批號(hào)：111538-200403)、槲皮素(批號(hào)：100081-200406)、木犀草素(批號(hào)：111720-200603)對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；芹菜素(批號(hào)：20090304)、芫花素(批號(hào)：90007586)對(duì)照品分別購(gòu)自天津尖峰天然產(chǎn)物研究開(kāi)發(fā)有限公司和阿法埃莎化學(xué)有限公司；12批祛痰止咳顆粒由廣州市花城制藥廠(chǎng)提供。

甲醇 (美國(guó)Burdick & Jackson) 為色譜純；甲醇(廣東光華化學(xué)廠(chǎng)有限公司)、冰醋酸(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取金絲桃苷、槲皮素、木犀草素對(duì)照品各1mg，槲皮苷、芹菜素、芫花素對(duì)照品各2 mg，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含金絲桃苷、槲皮素、木犀草素各0.1 mg，含槲皮苷、芹菜素、芫花素各0.2 mg的混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取祛痰止咳顆粒10袋，研細(xì)，取約16 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理(功率360 W，頻率35 kHz)30 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液50 mL，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)铀s5 mL溶解，定量轉(zhuǎn)移至固相萃取小柱(填料：C18，規(guī)格：6 mL,500 mg)，加水20 mL分次淋洗，淋洗液棄去，再用甲醇20 mL分次洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)考尤爰状? mL，使完全溶解，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得祛痰止咳顆粒供試品溶液。紫花杜鵑、芫花等5味藥材按處方比例折算，稱(chēng)取粉末，分別制成單味藥材供試品溶液以及陰性缺味的供試品溶液，同法處理。

2.2 色譜條件

依利特 Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；以甲醇為流動(dòng)相A，以φ=0.15%冰醋酸溶液為流動(dòng)相B，線(xiàn)性梯度洗脫：0～95 min，A(15%→75%)；流速為1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。理論塔板數(shù)按以芹菜素計(jì)算不低于9 000。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 按“供試品溶液的制備”方法制備祛痰止咳顆粒供試品溶液(批號(hào)：090308)，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄HPLC色譜圖，以保留時(shí)間64 min峰面積較大、較穩(wěn)定的色譜峰(17號(hào)峰)芹菜素作為參照峰，計(jì)算各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD。結(jié)果各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.04%～0.80%,相對(duì)峰面積的RSD為1.06%～2.00%；采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》進(jìn)行評(píng)價(jià)，相似度大于0.999，表明儀器精密度好。

2.3.2 穩(wěn)定性考察 按“供試品溶液的制備”方法制備祛痰止咳顆粒供試品溶液(批號(hào)：090308)，分別在0、2、4、6、8、10、24 h進(jìn)樣分析，記錄HPLC色譜圖，以芹菜素色譜峰為參照峰，計(jì)算各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD。結(jié)果各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.01%～0.88%,相對(duì)峰面積的RSD為1.13%～2.08%；采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》進(jìn)行評(píng)價(jià)，相似度大于0.999，表明供試品溶液在放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批祛痰止咳顆粒(批號(hào): 090308)，按“供試品溶液的制備”方法平行操作，制備6份祛痰止咳顆粒供試品溶液，分別進(jìn)樣分析，記錄HPLC色譜圖，以芹菜素色譜峰為參照峰，計(jì)算各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD。結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.05%～0.16%，相對(duì)峰面積的RSD為1.12%～2.69%；采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》進(jìn)行評(píng)價(jià)，相似度大于0.999，表明該方法重復(fù)性好。

2.4 祛痰止咳顆粒指紋圖譜的構(gòu)建及相關(guān)技術(shù)參數(shù)

2.4.1 指紋圖譜的構(gòu)建 取12個(gè)批號(hào)的祛痰止咳顆粒供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，將12批成品的數(shù)據(jù)采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004 A版》進(jìn)行評(píng)價(jià)，確定19個(gè)共有峰并獲得共有模式(參照指紋圖譜)見(jiàn)圖1。結(jié)果表明12批祛痰止咳顆粒的相似度均大于0.90，證明祛痰止咳顆粒的生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，產(chǎn)品的均一性較好，結(jié)果見(jiàn)圖2及表1。

表1 12批祛痰止咳顆粒相似度評(píng)價(jià)表

圖1 祛痰止咳顆粒的HPLC參照指紋圖譜

圖2 12批祛痰止咳顆粒相似度評(píng)價(jià)結(jié)果圖

2.4.2 共有峰的標(biāo)定及藥材歸屬 分別精密吸取單味藥材及陰性缺味供試品溶液，注入液相色譜儀，采集色譜圖。通過(guò)對(duì)比分析，19個(gè)共有峰中，歸屬于君藥紫花杜鵑的色譜峰有3個(gè)，分別為第7、11、15號(hào)峰；歸屬于臣藥芫花的色譜峰應(yīng)有7個(gè)，分別為第6、8、9、12、15、17、19號(hào)峰；歸屬于甘遂的色譜峰應(yīng)有3個(gè)，分別為2、4、5號(hào)峰，其中2號(hào)峰為黨參和甘遂的共有峰；1號(hào)峰為所有藥材的共有峰。同時(shí)，在此分析條件下，水半夏成分峰在圖譜上沒(méi)有體現(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖3、4、5。

2.4.3 色譜峰的定性分析

1) 對(duì)照品對(duì)照法 取金絲桃苷、槲皮素、木犀草素、槲皮苷、芹菜素、芫花素的混合對(duì)照品溶液及祛痰止咳顆粒供試品溶液適量，按“2.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，采集色譜圖，根據(jù)色譜峰的保留時(shí)間定位以及化學(xué)成分的PDA光譜圖信息對(duì)比，確定7號(hào)峰、11號(hào)峰、14號(hào)峰、15號(hào)峰、17號(hào)峰、19號(hào)峰分別為金絲桃苷、槲皮苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素、芫花素，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖3 祛痰止咳顆粒指紋圖譜、紫花杜鵑藥材色譜圖及缺紫花杜鵑陰性色譜圖

圖4 祛痰止咳顆粒指紋圖譜、芫花材色譜圖及缺芫花陰性色譜圖

圖5 祛痰止咳顆粒指紋圖譜、甘遂材色譜圖及缺甘遂陰性色譜圖

圖6 混合對(duì)照品圖與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜

2) LC-ESI-MS/MS成分鑒別 采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×50 mm，1.8 μm)柱，甲醇-0.15%(φ)冰醋酸溶液作為流動(dòng)相，對(duì)祛痰止咳顆粒色譜成分進(jìn)行分析。ESI-MS/ MS參數(shù)：干燥氮?dú)鉁囟?50 ℃，流量13.0 L/min，霧化器壓力40 psi，毛細(xì)管電壓4 000 V，掃描質(zhì)量范圍m/z 100～1 000。黃酮類(lèi)化合物中的羥基容易形成穩(wěn)定的氧負(fù)離子，故用負(fù)離子模式檢測(cè)有較好的信噪比。通過(guò)質(zhì)譜的分子離子峰、裂解碎片，結(jié)合紫外吸收光譜特征，相關(guān)文獻(xiàn)[2-7]以及對(duì)照品對(duì)照，對(duì)顆粒中的色譜峰進(jìn)行歸屬，確證6個(gè)化學(xué)成分，指證4個(gè)化學(xué)成分，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 祛痰止咳顆?；瘜W(xué)成分質(zhì)譜歸屬

*為有對(duì)照品對(duì)照

3 討 論

1) 本研究首次構(gòu)建了祛痰止咳顆粒高效液相(HPLC)指紋圖譜，采用二元線(xiàn)性梯度洗脫，在波長(zhǎng)260 nm下檢測(cè)出19個(gè)共有色譜峰。在此色譜條件下，能同時(shí)檢出祛痰止咳顆粒中紫花杜鵑、芫花、甘遂、黨參四味藥材，歸屬于紫花杜鵑的色譜峰有3個(gè)，歸屬于芫花的色譜峰有7個(gè)，歸屬于甘遂的色譜峰有3個(gè)，歸屬于黨參的色譜峰有1個(gè) ，該峰與甘遂共有。其中，紫花杜鵑和芫花分別為方中的君藥和臣藥，藥效學(xué)表明黃酮類(lèi)成分為這兩味藥鎮(zhèn)咳化痰的有效成分，在該方法下能同時(shí)檢出歸屬于芫花和紫花杜鵑藥材的10個(gè)黃酮類(lèi)成分，解決原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)無(wú)法全面控制該產(chǎn)品質(zhì)量的瓶頸問(wèn)題，為成品的內(nèi)在質(zhì)量提供了強(qiáng)有力的保障。

2) 采用HPLC-ESI/MS/MS及HPLC-PDA對(duì)祛痰止咳顆粒圖譜中的色譜峰進(jìn)行分析，通過(guò)質(zhì)譜的分子離子峰、裂解碎片，結(jié)合紫外吸收光譜特征，與對(duì)照品對(duì)照，鑒定出指紋圖譜中的10個(gè)化學(xué)成分：峰確證6個(gè)化學(xué)成分，分別為金絲桃苷、槲皮苷、芫根苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素、芫花素；指證4個(gè)化學(xué)成分，分別為芹菜素-7-O- β-D-葡萄糖醛酸苷、芫根苷、椴苷、羥基芫花素；采用歸一化法對(duì)12批成品指紋圖譜中的共有特征峰進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，已知成分的色譜峰面積之和占共有色譜峰面積總和的66%以上。

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