余 倩

(1.仲愷農業(yè)工程學院輕工食品學院,廣東 廣州 510225 2.中山大學有害生物控制與資源利用國家重點實驗室,廣東 廣州 510275)

桿狀病毒是一類節(jié)肢動物專一性的病毒，它們帶有桿狀的核衣殼，基因組是由大小約為80～180 kb雙鏈環(huán)狀DNA所構成[1]。桿狀病毒的宿主范圍窄，大部分桿狀病毒只能感染幾種昆蟲甚至是專一性的一種。

桿狀病毒生活周期主要分為以下幾步：進入細胞、早期基因表達、DNA的復制、晚期基因表達、極晚期基因表達、芽生型病毒(budded virus, BV)的組裝和釋放、核多角體蛋白包含體(occlusion-derived virus, ODV)的形成。

斜紋夜蛾核多角體病毒(Spodopteralituranucleopolyhedrovirus,SpltNPV)和甜菜夜蛾核多角體病毒(Spodopteraexiguamultiple nucleopolyhedrovirus,SeMNPV)的全基因組已完成測序[2-3]，兩者的基因組相似性程度高，經研究發(fā)現兩者不能交叉感染各自宿主，SeMNPV感染SpLi-221細胞會引起細胞凋亡[4]，而SpltNPV感染Se301細胞的研究還未見報導。為了了解SpltNPV感染Se301細胞的進程并尋找病毒感染失敗的原因，本研究對SpltNPV感染后的Se301細胞進行了生化分析，發(fā)現病毒蛋白表達受阻是SpltNPV感染Se301細胞失敗的主要原因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 昆蟲細胞與病毒 野生型SpltNPV中山大學分離株(ZSU strain)由本實驗室保存。SeMNPV-SeUS1引自美國加州大學Riverside分校B.A.Federici教授實驗室。甜菜夜蛾細胞Se301由荷蘭Wageningen大學J.M.Vlak教授惠贈，用w=10 %胎牛血清的Grace′s培養(yǎng)基 (Invitrogen) 27 ℃培養(yǎng)。

1.1.2 供試昆蟲 斜紋夜蛾、甜菜夜蛾幼蟲由本實驗室養(yǎng)蟲室提供，為人工飼料飼養(yǎng)的健康幼蟲。人工飼料配方見參考資料[5]，飼養(yǎng)溫度 27～28 ℃。

1.2 方法

1.2.1 病毒多角體擴增 將病毒多角體涂布于人工飼料表面喂飼感染4齡初的昆蟲幼蟲，感染4～5 d后收集呈現典型病毒感染癥狀的幼蟲(蟲體倒掛，身體腫脹，呈灰白色)，置室溫下靜置2至3天讓其自然發(fā)酵(病毒進一步成熟和蟲體進一步液化)。用10倍的PBS懸浮發(fā)酵的蟲尸，經四層紗布過濾，濾液經3 000 r/min離心10 min，沉淀物重懸于適量PBS中，600 r/min離心5 min，收集上清。如此重復3～4次，直至多角體懸浮液呈乳白色，光學顯微鏡檢查在多角體懸液中雜質很少，即為較純的病毒多角體。

1.2.2 病蟲血淋巴制備 用多角體喂飼感染四齡初昆蟲幼蟲,感染3 d后經鏡檢有極少量多角體出現即取血淋巴。用φ=70 %乙醇將病蟲表面消毒，剪開腹足，血淋巴滴入含w=0.1 %苯基硫脲的Grace′s 培養(yǎng)基中，3 000 r/min離心10 min，除去血淋巴細胞，取上清經過濾滅菌保存，供細胞感染用。

1.2.3 在離體培養(yǎng)細胞中增殖病毒 吸盡單層培養(yǎng)細胞中培養(yǎng)液，按感染復數(MOI)大約為1的接種量接種病毒血淋巴，室溫吸附1 h，吸棄病毒液，以無抗生素無血清Grace′s培養(yǎng)基洗2次，然后加入新鮮Grace′s培養(yǎng)基，27 ℃培養(yǎng)72 h～96 h左右，收集細胞上清，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4SpltNPV 病毒感染細胞 在35 mm培養(yǎng)皿中以0.5×106個細胞/孔密度接種對數生長期的Se301細胞；貼壁1 h后，移出培養(yǎng)基，SpltNPV病毒以MOI為1感染細胞，27 ℃培養(yǎng)1 h并間隔搖動培養(yǎng)板；1 h后棄感染液，以無抗生素無血清Grace′s培養(yǎng)基洗2次，然后加入Grace′s培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，加入病毒即開始計時，于感染后不同時間收集取樣，3 000 r/min離心10 min，棄上清，細胞沉淀先放入液氮速凍30 min，再放入-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 Dot Blotting 收取感染后細胞樣品提取總DNA融于8 mmol/L NaOH，調整至終濃度100 μg/mL，測定吸光度。每個樣品取10 μL，100 ℃煮5 min，冰上迅速冷卻。于Dot Blotting裝置上點樣轉膜。方法參照Bio-Dot SF Microfiltration Apparatus(Bio-Rad, Inc)操作手冊。主要步驟包括：DNA固定，探針制備和標記，地高辛雜交，雜交后洗膜，檢測和顏色反應。

1.2.6 RT-PCR RT-PCR反應按TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0操作手冊進行。 取反應液5 μL進行凝膠電泳，確認反應產物。以RNA為模板進行PCR擴增，以檢測模板是否存在DNA污染。所用引物序列見表1，引物由上海英駿生物工程公司合成。

1.2.7 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 收集細胞上清，加等量的2×蛋白上樣緩沖液，于沸水中煮5～10 min，按常規(guī)方法在Bio-Rad小型蛋白電泳儀上進行恒流電泳。電泳結束后，用考馬斯亮藍染色后用脫色液進行脫色，觀察蛋白帶型。

1.2.8 Western blotting 收集病毒感染后細胞，PBS緩沖液洗2次，細胞裂解后進行蛋白電泳，轉膜，蛋白封閉，以制備的POLYHEDRIN多克隆抗體為一抗1∶500稀釋后進行western blotting檢測，觀察蛋白表達情況。

表1 PCR擴增所用引物

2 結 果

2.1 SpltNPV感染Se301細胞后DNA復制情況

本實驗室研究發(fā)現SpltNPV不能成功感染Se301細胞，而是誘導Se301細胞產生凋亡(資料未顯示)。為研究SpltNPV在Se301凋亡細胞中的感染進程以及病毒感染失敗的原因，首先進行dot blotting分析檢測病毒復制，正常Se301樣品為陰性對照，SpltNPV感染SpLi-221細胞為陽性對照，雜交探針為DIG標記的病毒polyhedrin基因(polyhedrin-dig), 標準樣品(Marker)為polyhedrin的PCR產物。檢測結果顯示：陽性對照樣品在感染后12 h能檢測到有病毒復制，且隨著時間的延長病毒量越來越多；SpltNPV感染Se301細胞樣品中從12 ～72 h也能檢測到病毒復制，但病毒復制的速度明顯低于SpltNPV感染SpLi-221細胞的復制速度，此結果說明SpltNPV感染Se301細胞后完成了病毒的復制但復制速度受到一定影響。

圖1 SpltNPV感染SpLi-221或Se301細胞的Dot blotting分析

2.2 SpltNPV在Se301細胞中的轉錄時相

病毒基因的轉錄分為極早期、早期、晚期和極晚期。極早期基因在感染后1h就能檢測到轉錄，感染后6 h之前轉錄的基因為早期基因，而感染后6h之后轉錄的基因為晚期基因，且感染后12 h之后轉錄的基因為極晚期基因。SpltNPV病毒在Se301細胞中進行了病毒的復制，可以推測病毒的早期基因應該進行了轉錄表達，下一步需了解病毒的晚期基因是否得到了轉錄及表達，從而可進一步驗證早期基因是否得到了轉錄和表達，現采取RT-PCR分析病毒在Se301細胞中的基因轉錄情況。設計3對引物以SpltNPV基因組為模板進行PCR反應，首先需鑒定引物是否正確(圖2)，結果顯示3對引物都能擴增出相應大小的條帶，說明設計引物無誤。

圖2 ieo、DNA polymerase、chitnase基因的PCR擴增產物

為確定SpltNPV病毒在Se301細胞中是否完成了轉錄，以及各基因的轉錄時間與SpltNPV病毒在受納細胞SpLi-221細胞中的轉錄時間是否一致，進行病毒基因的轉錄時相分析。結果如圖3顯示：SpltNPV感染Se301細胞1 h后能檢測到很微弱的ieo轉錄本，從4 h至48 h均能檢測到ie0的強轉錄本；DNApolymerase基因從6～48 h能檢測到強轉錄本；從8～48 h能檢測到chitnase的強轉錄本。總的來講，SpltNPV感染Se301細胞的基因轉錄時相與SpltNPV感染SpLi-221細胞的基因轉錄時相基本一致，只是極早期基因ie0至晚期也有轉錄。

2.3 SpltNPV在Se301細胞中的蛋白表達

SpltNPV感染Se301細胞后病毒的所有基因都得到了轉錄，病毒蛋白的表達情況又如何？采取SDS-PAGE和Western blotting分析檢測病毒感染Se301細胞后其蛋白的表達情況。由于光鏡觀察SpltNPV感染Se301細胞48 h時有明顯病理癥狀(資料未顯示)，所以收取Se301細胞樣品和SpltNPV感染Se301細胞48 h樣品進行SDS-PAGE分析比較；Se301細胞為SpltNPV的非受納細胞，感染進程可能與SpltNPV感染受納細胞SpLi-221不同，所以收取SpltNPV感染SpLi-221細胞24、48和72 h (圖4所示)樣品與SpltNPV感染Se301細胞48 h樣品進行SDS-PAGE分析比較。結果顯示：SpltNPV感染SpLi-221細胞無論在24、48和72 h樣品中很明顯都有一條29 700的POLYHEDRIN條帶，且總蛋白表達條帶在24、48和72 h沒有明顯區(qū)別；而正常的Se301細胞和SpltNPV感染Se301細胞48 h樣品中沒有此條帶；對正常Se301細胞和SpltNPV感染Se301細胞48 h樣品的總蛋白帶型進行比較，觀察不到蛋白帶型明顯的區(qū)別。所以SpltNPV感染Se301細胞后蛋白表達受到了一定程度的限制，極晚期基因polyhedrin的表達受阻。

圖3 RT-PCR分析ieo、DNA polymerase、 chitnase基因的轉錄

圖4 SpltNPV感染Se301細胞SDS-PAGE分析

用極晚期基因polyhedrin的多克隆抗體對SpltNPV感染Se301細胞24、48、72 h樣品進行Western blotting分析，結果如圖5表明細胞被感染24，48，72 h極晚期基因polyhedrin沒有表達?？偟膩碇vSpltNPV感染Se301細胞后其蛋白表達受阻，以至于不能完成整個的病毒復制。

圖5 SpltNPV感染Se301細胞polyhedrin基因Western blotting分析

3 討 論

SpltNPV和SeMNPV基因組相似性很高,但這兩種病毒不能交叉感染各自宿主。先前研究表明細胞凋亡是限制桿狀病毒感染昆蟲的主要原因之一，早有關于桿狀病毒誘導細胞凋亡從而導致病毒感染失敗的報導，如HycuNPV誘導的Ld652Y細胞凋亡[6]；HaSNPV誘導的Hi5和s1-zsu-1細胞凋亡[7-8]；SeMNPV感染SpLi-221細胞會引起細胞凋亡；SpltNPV感染Se昆蟲也可誘導昆蟲體液細胞凋亡[9]，且本實驗室研究發(fā)現SpltNPV感染Se301細胞也誘導了細胞凋亡。

桿狀病毒生活周期主要分為以下幾步：進入細胞、早期基因表達、DNA的復制、晚期基因表達、極晚期基因表達、BV的組裝和釋放、核多角體蛋白包含體的形成。SpltNPV不能成功感染Se301細胞產生子代病毒，即Se301細胞為SpltNPV的非受納細胞。

研究顯示SpltNPV感染Se301細胞后病毒完成了整個DNA復制過程，但DNA復制量明顯低于SpltNPV感染其原宿主細胞SpLi-221細胞的DNA復制量，分析其原因可能是由于病毒感染其非受納宿主細胞感染進程受阻。DNA復制之前是病毒早期基因的表達，研究證實桿狀病毒誘導的凋亡可由感染早期的事件所引起[10]，先前研究表明病毒的極早期基因ie1能引起由AcMNPV誘導的Sf21細胞凋亡[11]。 本研究中ie0基因的表達也可能會引起細胞凋亡，使得大部分病毒感染失敗，只有少量病毒能完成DNA復制，所以觀察到病毒感染受納和非受納細胞DNA復制速度不同。

病毒轉錄時相分析結果表明病毒的所有基因都完成了轉錄，且早期基因和晚期基因的轉錄時相與SpltNPV感染其原宿主的轉錄時相一致，符合桿狀病毒感染其原宿主的一般轉錄時相規(guī)律，但實驗中發(fā)現極早期基因ie0的轉錄在1 h時較正常原宿主感染量弱，且基因轉錄延遲到了感染后期即24 h以后。一般的極早期基因轉錄只在感染的早期出現，到感染后期沒有極早期基因的轉錄，可能由于病毒感染進程不一致，導致一部分病毒進入感染晚期而一部分病毒還處于其它感染階段。

經檢測Se301細胞與SpltNPV感染Se301細胞的總蛋白表達情況沒有明顯不同，且與SpltNPV感染SpLi-221細胞總蛋白表達進行比較，發(fā)現SpltNPV感染Se301細胞中無極晚期POLYHEDRIN蛋白的表達，Western blotting檢測結果與上述結果一致，說明病毒的蛋白表達受到了一定程度的限制，極晚期基因的表達受阻。

綜合以上分析結果，病毒進入細胞首先進行早期基因表達，可能因為早期基因的表達誘導了細胞凋亡，所以大部分病毒感染失敗，只有少量病毒進行DNA復制和轉錄，DNA復制后病毒隨即進行晚期或極晚期基因表達[12]，由于某種未知原因，也可能是其它因素誘導了細胞發(fā)生凋亡，病毒晚期基因的表達受到抑制以至不能完成BV的裝配和產生子代病毒?？偟膩碚f，病毒蛋白表達受阻是SpltNPV在Se301細胞中無法形成子代病毒，完成整個病毒復制的主要原因，本研究為深入研究其感染失敗機理奠定了堅實基礎。

致謝本研究在中山大學龐義教授和楊凱教授的指導和幫助下完成，謹以感謝。

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