楊慧芳

心肌細(xì)胞內(nèi)向整流鉀電流Kir主要參與心肌細(xì)胞動(dòng)作電位的4級(jí)靜息電位過(guò)程，與心肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程(APD)和有效不應(yīng)期(ERP)的長(zhǎng)短密切相關(guān)，對(duì)維持心肌細(xì)胞正常生理功能有重要的作用，IK的異常也常常是心律失常的因素之一［1］。IK主要維持心肌細(xì)胞的靜息膜電位，是動(dòng)作電位的重要組成部分，是維持心室肌細(xì)胞正常功能活動(dòng)的重要電流。本文研究小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)向整流鉀電流Kir2.1的在靜息膜電位中的參與與在所有內(nèi)向整流鉀電流中所占比例。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 豚鼠8只，體重200～250 g。本實(shí)驗(yàn)中豚鼠由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 試劑與溶液

1.2.1 試劑:Ⅱ型膠原酶(collagenase typeⅡ)為 GIBCO公司生產(chǎn)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2.2 溶液:①無(wú)鈣臺(tái)氏液:NaCl 137.7 mmol/L，NaOH 2.3 mmol/L，KCl 5.4 mmol/L，MgCl 21 mmol/L，N-(乙羥乙基)哌嗪-N-2乙烷磺酸(HEPES)5 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L(用NaOH調(diào) pH 值 至 7.4);②KB 液:KCl 83 mmol/L，K2HPO430 mmol/L，MgSO45 mmol/L，KOH 2 mmol/L，丙 酮 酸 鈉5 mmol/L，牛 磺 酸 20 mmol/L，葡 萄 糖 10 mmol/L，EGTA 0.5 mmol/L，HEPES 5 mmol/L，(用 KOH 調(diào) pH 值至 7.2);③記錄Kir2.1的電極內(nèi)液;④記錄 Kir的電極外液:NaCl 150 mmol/L，KCl10 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，MgCl25.4 mmol/L，用NaOH調(diào)pH值至7.4。

1.3 儀器 膜片鉗放大器Axon 200B為美國(guó)Axon公司產(chǎn)品;電極拉制器和三位操縱器均為Sutter公司產(chǎn)品;倒置顯微鏡TE2000-S為Nikon公司產(chǎn)品。

1.4 方法 豚鼠心肌細(xì)胞的急性分離:將豚鼠麻醉后快速開(kāi)胸取出心臟，至于冰無(wú)鈣臺(tái)式液中進(jìn)行主動(dòng)脈插管，連于Langendorff灌流裝置上，進(jìn)行恒壓恒溫逆行灌流。灌流液溫度37℃，流速7 ml/min，用前用100%O2飽和。先用無(wú)鈣臺(tái)氏液灌流5 min，沖洗心臟中殘留的血液，然后灌以含12 mg/mlⅡ型膠原酶的無(wú)鈣臺(tái)氏液，循環(huán)灌流心臟1 520 min，之后再用無(wú)鈣臺(tái)氏液灌流，以沖洗心臟中殘留的膠原酶。將消化后的心肌剪下，置于KB液中剪碎，輕輕吹打至細(xì)胞分散。待細(xì)胞沉降后置換KB液，室溫下靜置1 h后用于膜片鉗記錄。

1.5 膜片鉗記錄 實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)全細(xì)胞膜片鉗方法記錄心肌細(xì)胞Kir2.1電流。將部分靜置的細(xì)胞放入浴槽中，待細(xì)胞貼壁后灌以外液。應(yīng)用電極拉制儀將薄細(xì)毛坯電極拉制成應(yīng)用電極并拋光待用。將電極接觸與細(xì)胞表面給予一定負(fù)壓，在細(xì)胞膜表面與電極尖之間形成緊密的封接，達(dá)GΩ。施加更大的負(fù)壓使細(xì)胞膜破膜，補(bǔ)償電極電容和串聯(lián)電阻，達(dá)到全細(xì)胞記錄模式(whole-cell recording)。記錄豚鼠心室肌細(xì)胞Kir2.1電流，并給予500 mmol/L BaCl2溶液，觀察與記錄Kir2.1的變化，并統(tǒng)計(jì)Kir2.1在心肌細(xì)胞內(nèi)向整流鉀離子電流中所占比例。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用Clampfit 9.0(美國(guó)Axon公司)和Origin 7.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ba2+對(duì)IKir2.1的作用 應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗記錄Ba2+對(duì)豚鼠心肌細(xì)胞中Kir2.1的作用。全細(xì)胞記錄Kir2.1的protocol是采用牽制電壓為－120 mV逐漸升至40 mV再回到－120 mV。IK的電壓依賴性研究應(yīng)用牽制在－80 mV，再階躍到80 mV，再回到 －80 mV，依次從80 mV以10 mV降低至－30 mV。記錄到IKir2.1明顯被抑制，抑制率為(81±7)%。見(jiàn)圖1。

2.2 Ba2+抑制豚鼠心肌細(xì)胞Kir2.1的統(tǒng)計(jì) 見(jiàn)圖2。

圖1 500 mmol/L的Ba2+對(duì)Kir2.1 的作用

圖2 Ba2+抑制豚鼠心肌細(xì)胞統(tǒng)計(jì)圖

3 討論

Kir2.1主要分布于心肌細(xì)胞，對(duì)維持心肌細(xì)胞的靜息電位以及心肌復(fù)極過(guò)程起著重要的作用。其異常是導(dǎo)致心律失常的重要機(jī)制之一，同時(shí)也是導(dǎo)致其他器官異常的重要因素，例如它參與帕金森病形成等［1］，國(guó)內(nèi)外研究人員對(duì)于Kir2.1的調(diào)節(jié)機(jī)制研究已經(jīng)有很多的基礎(chǔ)。對(duì)于心肌細(xì)胞內(nèi)向整流鉀電流中Kir2.1所占比例，有諸多的研究［2］。心肌細(xì)胞的內(nèi)向整流鉀離子電流由多種鉀離子電流組成，心肌細(xì)胞的內(nèi)向整流鉀離子電流由多種鉀離子電流組成，在心臟的生理活動(dòng)中起舉足輕生的作用［3－5］，本文主要研究Kir2.1對(duì)豚鼠心肌細(xì)胞內(nèi)向整流鉀離子組成的貢獻(xiàn)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究，我們發(fā)現(xiàn)Kir2.1在豚鼠心肌細(xì)胞中所占比例，即被Ba抑制的電流比例，為(81±7)%。說(shuō)明Kir2.1是心肌細(xì)胞內(nèi)向整流鉀離子電流的主要組成部分，并且還有其他的電流組成部分，他們?cè)诰S持心肌細(xì)胞的正常生理功能方面起著重要作用。

1 Regina PM，Günter S，Tobias G，et al.Heteromerzation of Kir2.x potassium channels contributes to the phenotype of Andersen’s syndrome.Physiology，2002，99:7774-7779.

2 GX Liu，C Derst，G Schlichthrl，et al.Comparison of cloned Kir2 channels with native inward rectifier K+channels from.Physiol，2001，532:115-126.

3 Jongsma HJ，Wilders R.Channelopathies:Kir2.1 mutations jeopardize many cell functions.Curr Biol，2001，11:R747-750.

4 Abraham MR，Jahangir A，Alekseev AE，et al.Channelopathies of inwardly rectifying potassium channels.FASEB J，1999，13:1901-1910.

5 He Y，Pan Q，Li J，et al.Kir2.3 knock-down decreases IK1 current in neonatal rat cardiomyocytes.FEBS Letters，2008，582:2338-2342.