陳麗麗 黃 靚妹 詹 紅艷 曹亦賓

實驗動物模型是研究癲癇的重要手段。研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射匹魯卡品(pilocarpine，PILO)是誘導癲癇發(fā)作的一種簡單方便的動物模型［1，2］。PILO通過同時激動乙酰膽堿和谷氨酸受體導致大鼠癲癇發(fā)作。發(fā)作后可引起分為3個階段的行為和腦電圖變化:急性期:邊緣性癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepsy，SE)可持續(xù)至24 h;靜止期:腦電圖(EEG)和行為基本正常，4～42 d;慢性自發(fā)性復發(fā)性發(fā)作(spontaneous recurrent seizures，SRS):類似于復雜部分性發(fā)作的患者，每只動物發(fā)作2～3次/周［3］。長期發(fā)作可引起類似人類顳葉癲癇的病理改變，如神經(jīng)元缺失、膠質(zhì)細胞增生、苔蘚纖維出芽等［4，5］。因此，該模型已作為理想的動物模型之一，用于癲癇的實驗研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性成年Wistra大鼠60只，體重200～250 g，由河北聯(lián)合大學動物實驗部提供。隨機分為2組，癲癇模型組(模型組)30只;0.9%氯化鈉溶液對照組(對照組)30只。均進行Nissl染色及Timm銀染。

1.2 藥品 PILO由美國SIGMA公司提供，硝酸銀由廣州市立新化工廠生產(chǎn)，戊巴比妥鈉由北京化工廠生產(chǎn)，焦油紫(Crestyl Violet)由美國SIGMA公司生產(chǎn)，氫醌由湖北大學化工廠生產(chǎn)。

1.3 動物模型制作 大鼠腹腔注射PILO 350 mg/kg，注入前30 min腹腔注入東莨宕堿1 mg/kg，以拮抗其外周膽堿能反應;注射后根據(jù)Racine［6］制定的標準判定是否有癲癇發(fā)作，并于實驗當天行EEG檢查。對照組大鼠腹腔注等量0.9%氯化鈉溶液，觀察有無癲癇發(fā)作，也于實驗當天行EEG檢查。Racine標準:0級無驚厥、Ⅰ級面部陣攣、Ⅱ級面部陣攣+節(jié)律點頭、Ⅲ級面部陣攣+節(jié)律點頭+前肢陣攣、Ⅳ級面部陣攣+節(jié)律點頭+前肢陣攣+后肢站立、Ⅴ級面部陣攣+節(jié)律點頭+前肢陣攣+后肢站立+跌倒。

1.4 灌注和取材 模型組及對照組用于Nissl染色的大鼠分別于給藥后3、7、10、30、60 d 灌注取材;用于 neo-Timm 染色的大鼠分別于 3、7、10、30、60 d 灌注取材。

1.5 Nissl染色 切片置于二甲苯中脫脂3 min后依次放入100%、95%、70%乙醇各3 min加水，蒸餾水漂洗3 min，0.1%Crestyl Violet染色10～20 s，鏡下觀察背景呈白色或無色;而后依次放入70%、95%、100%乙醇各1～2 min脫水，再移入二甲苯透明至少5～10 min后，中性樹膠封片;Olympus光學顯微鏡觀察，并拍照。半定量評估CA1、CA3、門區(qū)神經(jīng)細胞丟失程度，評分標準［7］0:無損害;1:1% ～10%神經(jīng)元缺失，伴輕度軸突變性;2:11% ～50%細胞缺失，伴相當多的纖維變性;3:超過50%的細胞缺失，伴密集延長的軸突變性。

1.6 Timm銀染 將50%阿拉伯膠60 ml檸檬酸緩沖液10 ml、5.6%氫醌 30 ml、17%硝酸銀 1.5 ml于暗室中混合均勻［8］;暗室中將干燥切片浸入新鮮配制的孵育液后，置26℃水浴箱中孵育1 h以上后，傾去孵育液，流水沖洗15～20 min;切片干燥后，行Nissl復染(同前)，中性樹膠封片;光鏡下行齒狀回顆粒上區(qū)Timm銀染苔蘚纖維出芽評分，評分標準［9］見表1。

1.7 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，每只大鼠的各項數(shù)據(jù)均采用盲法對每只動物的5張切片進行平均后產(chǎn)生，計量資料以±s表示，半定量評分比較采用秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 顆粒上區(qū)苔蘚纖維出芽Timm銀染顆粒評分標準

2 結(jié)果

2.1 動物行為學觀察及腦電圖 模型組:PILO給藥的30只大鼠中，1只死于癲癇持續(xù)狀態(tài)，其余大鼠均可觀察到邊緣性發(fā)作行為表現(xiàn)，即豎立、奔跑、濕狗樣抖動，繼發(fā)以面部自動癥如眨眼、咀嚼及點頭。按Racine標準，Ⅱ～Ⅲ級發(fā)作2只，Ⅳ～Ⅴ級發(fā)作26只，未發(fā)作1只，每次發(fā)作持續(xù)約40 s，連續(xù)5～24 h。給藥3 d后及60 d內(nèi)行為表現(xiàn)呈慢性復發(fā)性癇性發(fā)作，Ⅱ～Ⅲ級，2～3次/周，表現(xiàn)為前腭陣攣、咀嚼，單肢陣攣等，每次持續(xù)約20～30 s。模型成功率為93%。Ⅳ級以上腦電圖均可見癲癇波(圖1)。對照組:腹腔注射0.9%氯化鈉溶液，30只大鼠未觀察到邊緣性發(fā)作行為表現(xiàn)及癲癇發(fā)作。

2.2 Nissl染色 正常大鼠CA3、CA1區(qū)有大量致密錐體細胞，齒狀回門區(qū)有中等量神經(jīng)元。本研究對照組各區(qū)神經(jīng)元未見丟失與變形，與正常大鼠無差別。PILO注射3 d后，CA3區(qū)錐體細胞大量缺失伴細胞變性，CA1區(qū)錐體細胞也開始缺失;7 d后，可以觀察到顆粒細胞發(fā)散并持續(xù)30 d，同時CA1區(qū)變性;30 d后，門區(qū)和CA1區(qū)可見大量膠質(zhì)細胞增生;60 d時更明顯(圖2)。模型組各區(qū)神經(jīng)元缺失情況。見表1。

表1 模型組海馬各區(qū)神經(jīng)缺失程度評分比較 分(張)

2.3 Timm銀染 正常情況下，海馬苔蘚纖維(mossy-fibre，MF)終止于CA3區(qū)錐體層和門區(qū)神經(jīng)元，并有大量Timm顆粒分布，齒狀回顆粒上區(qū)只有極少量Timm顆粒分布。本研究所有對照組大鼠切片顆粒上區(qū)均未見苔蘚纖維著色，也未見Zn2+標記的苔蘚纖維末梢增加(圖3)。模型組PILO注射10 d后，多數(shù)大鼠門區(qū)觀察到富含Zn2+的苔蘚纖維并伸向CA3區(qū)，并可見單獨的苔蘚纖維穿過顆粒細胞后進入內(nèi)分子層，但與同期對照組染色無差別;30 d后幾乎所有大鼠內(nèi)分子層均見富含Zn2+的苔蘚纖維末梢;60 d后，苔蘚纖維出芽非常明顯，內(nèi)分子層可清楚地看到含Zn2+末梢并形成異常帶，分子層外2/3未見Timm顆粒帶形成(圖4)。模型組與對照組苔蘚纖維出芽Timm銀染顆粒評分比較，差異有統(tǒng)計學意義(u=－3.365，P＜0.05)。見表2。

3 討論

3.1 神經(jīng)元丟失 正常海馬結(jié)構中CA1和CA3區(qū)主神經(jīng)元為錐體細胞，齒狀回主神經(jīng)細胞為顆粒細胞，門區(qū)主神經(jīng)元為中間神經(jīng)元。從CA1經(jīng)CA3至門區(qū)，神經(jīng)元形態(tài)和電生理特點呈連續(xù)變化過程，細胞自發(fā)放電增加，抑制性中間神經(jīng)元的作用逐漸減弱。而齒狀回顆粒細胞則不同，生理條件下齒狀回具有防止癲癇樣電活動在海馬網(wǎng)絡中的發(fā)生的作用。大量實驗證明成年動物癲癇持續(xù)狀態(tài)可引起海馬CA1、CA3區(qū)和齒狀回門區(qū)神經(jīng)元的丟失，齒狀回顆粒上區(qū)和CA1區(qū)錐體下層顆粒細胞軸突(苔蘚纖維)外生(出芽)［10，11］。本研究觀察了大鼠腹腔注射PILO后海馬各區(qū)神經(jīng)元的丟失情況。結(jié)果表明齒狀回門區(qū)神經(jīng)元、CA3錐體細胞大量丟失伴膠體細胞增生，CA1區(qū)錐體細胞少量丟失伴輕度變性及顆粒細胞發(fā)散，該結(jié)果與Cllifford等［4］研究基本一致。研究認為，海馬CA1區(qū)和齒狀回富含膽堿受體，CA3區(qū)和門區(qū)富含谷氨酸能受體，而癲癇發(fā)作后神經(jīng)元丟失最嚴重的卻是CA3區(qū)，其次是門區(qū)。神經(jīng)元丟失可能是通過特異性遞質(zhì)受體(谷氨酸受體)介導，因為谷氨酸可引起神經(jīng)元樹突的腫脹，神經(jīng)細胞體的水腫及變性。

表2 苔蘚纖維出芽Timm銀染顆粒評分 分(張)

圖1 癲癇模型組腦電圖

圖2 PILO注射60 d門區(qū)神經(jīng)元缺失伴膠質(zhì)細胞增生

圖3 癲癇對照組顆粒上區(qū)Timm銀染

圖4 PILO注射60 d顆粒上區(qū)Timm銀染

3.2 苔蘚纖維出芽 正常齒狀回苔蘚纖維起自顆粒細胞層，進入門區(qū)，其分支形成密集的網(wǎng)絡。門區(qū)的軸突就近傳至CA3區(qū)，終止于腔隙層而形成纖維束，在Timm銀染時表現(xiàn)為Timm顆粒。光鏡下見到的Timm顆粒已由電鏡證實位于超微結(jié)構的突觸末端［8］。苔蘚纖維出芽是指在內(nèi)分子層形成的神經(jīng)可塑性改變，在切片上可見表現(xiàn)為Timm銀染著色區(qū)的改變。齒狀回內(nèi)分子層苔蘚纖維出芽是顳葉癲癇患者和顳葉癲癇動物模型一種重要的神經(jīng)可塑性變化［12］。本實驗中，PILO注射后10 d，可見單獨的苔蘚纖維穿過顆粒細胞層進入內(nèi)分子層;30 d后，幾乎所有大鼠內(nèi)分子層均見富含Zn2+的苔蘚纖維末梢;60 d后，在內(nèi)1/3分子層形成異常帶。切片上表現(xiàn)為Timm銀染著色區(qū)域的變化，由苔蘚纖維出芽和突觸重建產(chǎn)生。Tang等［13］研究表明，齒狀回門區(qū)苔蘚細胞的丟失與苔蘚纖維出芽有關，齒狀回門區(qū)神經(jīng)元是一組對興奮性毒性易損性神經(jīng)元，由不同的神經(jīng)元群組成，其中最主要的是苔蘚細胞，苔蘚細胞死亡，使得內(nèi)分子層顆粒細胞樹突的突觸后位點空隙，刺激了苔蘚纖維并形成新的興奮突觸環(huán)路，該環(huán)路產(chǎn)生正反饋而引起自發(fā)性癲癇發(fā)作。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在PILO模型中，神經(jīng)元丟失、癲癇持續(xù)狀態(tài)、苔蘚纖維出芽的密度和自發(fā)性癲癇發(fā)作的頻率有明確的相關性［14］。更進一步研究結(jié)果表明，中度海馬苔蘚(MF)出芽可由未產(chǎn)生神經(jīng)元損害的短期發(fā)作引起，而紅藻氨酸(KA)或點燃模型中見到的嚴重苔蘚纖維出芽可能是由長期的發(fā)作活動和神經(jīng)元缺失共同產(chǎn)生。

綜上可見，腹腔注射匹魯卡品簡單復制了人類癲癇的基本病理特征，是研究癲癇的一種簡便方法。

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