李春海 宋 樹英 桑 翠玲 李 文慧 尹俊

心肌遭受缺血損傷后恢復(fù)血流灌注，反而加重心肌損傷，稱之為心肌缺血再灌注損傷。其表現(xiàn)為心肌水腫、氧利用能力下降、心肌收縮功能和細(xì)胞-容積調(diào)節(jié)作用減弱或喪失，心室順應(yīng)性下降。常伴有水、鈉潴留，線粒體破碎，收縮帶壞死，細(xì)胞膜斷裂等。特別是細(xì)胞膜損傷后可致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，嚴(yán)重的線粒體肌漿網(wǎng)狀體內(nèi)的鈣積聚，可導(dǎo)致細(xì)胞的最終死亡［1］。心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制與局部的炎性反應(yīng)和凝血系統(tǒng)的激活有密切關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，組織因子(tissue factor，TF)在缺血再灌注損傷的發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用［2］。因而減少TF的合成與釋放是防治缺血再灌注損傷的重要措施。本研究設(shè)計(jì)合成了針對(duì)大鼠TF的反義寡脫氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide，AODN)，利用聚酰胺-胺型樹枝狀高聚物 (polyamidoamine dendrimers，PAMAM-D)納米載體介導(dǎo) AODN轉(zhuǎn)染至Lewis大鼠體內(nèi)，觀察了AODN對(duì)大鼠心肌缺血再灌注過程中脂質(zhì)過氧化損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 大鼠TF寡脫氧核苷酸序列合成 參考 Nakamura等［3，4］的報(bào)道，設(shè)計(jì)大鼠TF寡脫氧核苷酸，由TaKaRa寶生物工程有限公司合成，序列如下:反義寡脫氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide/TF，AS/TF):5’-CATGGGGATAGCCAT-3’(AODN);正義寡脫氧核苷酸(sense oligodeoxynucleotide/TF，S/TF):5’-ATGGCTATCCCCATG-3’(SODN對(duì)照);錯(cuò)配寡脫氧核苷酸(scrambled oligodeoxynucleotide/TF，Sc/TF):5 ’-TGACGCAGAGAGTCGTA-3’(無關(guān)ODN對(duì)照)。將上述3種寡脫氧核苷酸按電荷比1∶10藕聯(lián)于G10代PAMAM-D納米載體［購(gòu)自Aldrich Chemical公司(Tokyo，Japan)］，構(gòu)建 ODN-PAMAM-D 的聚合物。

1.2 動(dòng)物分組 雄性 Lewis大鼠100只，體重230～280 g，隨機(jī)等分為5組:假手術(shù)組(n=20):每只動(dòng)物經(jīng)尾靜脈注入0.9%氯化鈉溶液1 ml。缺血再灌注組(n=20):每只動(dòng)物經(jīng)尾靜脈注入 PAMAM-D 12 mg/kg(溶于1ml 0.9%氯化鈉溶液)。AS/TF防治組(n=20):每只動(dòng)物經(jīng)尾靜脈注入AS/TFPAMAM-D 16 mg/kg(溶于1ml 0.9%氯化鈉溶液，相當(dāng)于AS/TF 4 mg/kg)。S/TF對(duì)照組(n=20):每只動(dòng)物經(jīng)尾靜脈注入S/TF-PAMAM-D 16 mg/kg(溶于1 ml 0.9%氯化鈉溶液，相當(dāng)于S/TF 4 mg/kg)。Sc/TF對(duì)照組(n=20):每只動(dòng)物經(jīng)尾靜脈注入Sc/TF-PAMAM-D 16 mg/kg(溶于1 ml 0.9%氯化鈉溶液，相當(dāng)于Sc/TF 4 mg/kg)。

1.3 制備心肌缺血再灌注損傷的動(dòng)物模型 5組大鼠完成上述注射后10 h腹腔注射20%烏拉坦溶液(1.0 g/kg)麻醉。開胸暴露心臟，除假手術(shù)組以外的其他4組大鼠于冠狀動(dòng)脈左前降支中1/2處結(jié)扎造成心肌缺血，通過觀察肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖確定心肌缺血是否復(fù)制成功。心肌缺血90 min后，解除結(jié)扎，再灌注3 h。假手術(shù)組的大鼠開胸暴露心臟后，于冠狀動(dòng)脈左前降支中1/2處只穿線，不結(jié)扎，持續(xù)270 min。

1.4 標(biāo)本取材及檢測(cè) 分別于缺血90 min和再灌注結(jié)束后取各組大鼠的腹主動(dòng)脈血液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)肌鈣蛋白T(troponin T，TnT)，并檢測(cè)丙二醛(malonaldehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)的含量(檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，檢測(cè)方法按配套說明書進(jìn)行)。將梗死區(qū)及邊緣區(qū)心肌組織剪下，一部分心肌組織用TRIzol提取RNA后，在1%瓊脂糖變性膠中進(jìn)行RNA甲醛變性電泳后，將RNA轉(zhuǎn)移并固定于硝酸纖維素膜(nitrocellulose，NC膜)上，以標(biāo)記有 α-32P dCTP的大鼠 TF cDNA作為探針進(jìn)行Northern blot。經(jīng)32P增感屏放射自顯影后，Molecular Imager FX system觀察結(jié)果，經(jīng)Syngene圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像掃描分析以確定各轉(zhuǎn)錄條帶的強(qiáng)弱。另一部分心肌組織提取蛋白質(zhì)后，采用一凝血法檢測(cè)TF的促凝活性(tissue factor procoagulant activity，TF:C)，采用 ELISA檢測(cè) TF抗原(tissue factor antigen，TF:Ag)。心肌組織蛋白定量采用Lowry法。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行完全隨機(jī)化設(shè)計(jì)資料的ANOVA方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5組大鼠血液中TnT和LDH的檢測(cè)結(jié)果 心肌缺血90 min及再灌注3 h后，與假手術(shù)組相比各缺血再灌注組大鼠血液中的TnT和 LDH均顯著增多(P ＜0.05或 ＜0.01)，而AS/TF防治組大鼠血液中的TnT和LDH則明顯低于其他3個(gè)缺血再灌注組(P ＜0.05)。見表1。

表1 5組大鼠血液中TnT和LDH比較 n=20，±s

表1 5組大鼠血液中TnT和LDH比較 n=20，±s

2.2 5組大鼠血液中MDA的含量 心肌缺血90 min及再灌注3 h后，與假手術(shù)組相比5組大鼠血液中的MDA含量均明顯增加(P＜0.05或 ＜0.01)，而AS/TF防治組大鼠血液中的MDA含量則顯著低于其他3個(gè)缺血再灌注組(P＜0.01)。見表2。

2.3 5組大鼠血液中SOD的含量 心肌缺血90 min及再灌注3 h后，與假手術(shù)組相比5組大鼠血液中的SOD含量均明顯減少(P ＜0.05或 ＜0.01)，而 AS/TF防治組大鼠血液中的 SOD含量則顯著高于其他3個(gè)缺血再灌注組(P＜0.05或 ＜0.01)。見表 3。

2.4 5組大鼠血液中GSH-PX的含量 心肌缺血90 min及再灌注3 h后，與假手術(shù)組相比5組大鼠血液中的GSH-PX含量均明顯減少(P ＜0.05或 ＜0.01)，而AS/TF防治組大鼠血液中的GSHPX含量則顯著高于其他3個(gè)缺血再灌注組(P＜0.05)。見表4。

表2 5組大鼠血液中MDA的含量n=20，nmol/ml，±s

表2 5組大鼠血液中MDA的含量n=20，nmol/ml，±s

注:與假手術(shù)組比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01;與缺血再灌注組比較，△P ＜0.01;與 AS/TF 防治組比較，☆P ＜0.01

組別 缺血前 缺血90min 再灌注3hrs假手術(shù)組13.7 ±2.5 13.9 ±2.5 13.8 ±2.5缺血再灌注組 13.5 ±2.2 26.5 ±4.3# 31.3 ±5.6#AS/TF 防治組 14.1±3.1 16.3±3.9＊△ 21.4±4.2#△S/TF 對(duì)照組 14.0 ±2.7 26.9 ±3.9#☆ 31.0 ±4.8#☆Sc/TF 對(duì)照組 13.8±2.1 27.0±3.7#☆ 31.2±5.2#☆

表3 5組大鼠血液中SOD的含量n=20，U/ml，±s

表3 5組大鼠血液中SOD的含量n=20，U/ml，±s

表4 5組大鼠血液中GSH-PX的含量n=20，mol/ml，±s

表4 5組大鼠血液中GSH-PX的含量n=20，mol/ml，±s

注:與假手術(shù)組比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01;與缺血再灌注組比較，△P ＜0.05;與 AS/TF 防治組比較，☆P ＜0.05

組別 缺血前 缺血90min 再灌注3hrs假手術(shù)組55.2 ±5.7 54.9 ±5.8 53.9 ±5.2缺血再灌注組 54.9 ±6.2 39.1 ±3.0# 26.8 ±2.8#AS/TF 防治組 53.8±4.8 47.8±3.4＊△ 36.4±4.9#*S/TF 對(duì)照組 54.4 ±5.1 40.2 ±3.0#☆ 25.9 ±2.9#☆Sc/TF 對(duì)照組 53.9±5.7 39.7±2.4#☆ 26.3±2.0#☆

2.5 5組TF基因的轉(zhuǎn)錄 Northern Blot檢測(cè)顯示，心肌缺血再灌注3 h后，缺血再灌注的4組大鼠梗死區(qū)及邊緣區(qū)心肌組織中的TF轉(zhuǎn)錄均強(qiáng)于假手術(shù)組，而AS/TF防治組大鼠梗死區(qū)及邊緣區(qū)心肌組織中的TF轉(zhuǎn)錄則較其他3個(gè)缺血再灌注組明顯減弱。見圖1。

圖1 5組TF基因的轉(zhuǎn)錄

2.6 5組大鼠心肌組織中TF的表達(dá) 缺血再灌注的各組大鼠梗死區(qū)及邊緣區(qū)心肌組織中的TF:C和TF:Ag水平均高于假手術(shù)組(P＜0.01)，而AS/TF防治組大鼠梗死區(qū)及邊緣區(qū)心肌組織中的TF:C和TF:Ag水平則明顯低于其他3個(gè)缺血再灌注組(P ＜0.01)。見表5。

表5 5組大鼠心肌組織中的TF:C(U/mg蛋白)和TF:Ag(ng/mg蛋白)n=20，±s

表5 5組大鼠心肌組織中的TF:C(U/mg蛋白)和TF:Ag(ng/mg蛋白)n=20，±s

注:與假手術(shù)組比較，*P ＜0.01;與缺血再灌注組比較，#P ＜0.01;與AS/TF防治組比較，△P ＜0.01

組別 TF:C(U/mg蛋白) TF:Ag(ng/mg蛋白)2.5 ±0.5 11.0 ±1.5缺血再灌注組 63.3 ±5.8* 95.4 ±5.6*AS/TF 防治組 33.2 ±3.1*# 46.7 ±3.2*#S/TF對(duì)照組 62.7±5.2＊△ 93.3±5.2＊△Sc/TF對(duì)照組 65.6±6.0＊△ 96.3±6.0假手術(shù)組＊△

3 討論

心肌缺血再灌注損傷是缺血性心臟病、冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)、心臟移植等諸多疾病或治療方法的重要病理生理過程，其發(fā)生機(jī)制與局部的凝血系統(tǒng)激活以及脂質(zhì)過氧化損傷有著密切關(guān)系［5］。

心肌缺血后恢復(fù)血流灌注，缺血的組織重新供氧，可形成和激活一系列體液炎性介質(zhì)，包括活性氧(超氧化物、氫氧自由基、過氧化氫等)、脂類介質(zhì)［血小板活化因子(platelet active factor，PAF)、白三烯 B4(leukotriene B4，LTB4)］以及多肽類介質(zhì)(補(bǔ)體C5A、細(xì)胞因子和黏附分子)等，從而引起炎性反應(yīng)［6］。炎性反應(yīng)可導(dǎo)致組織損傷，釋放TF［7］。TF又稱為凝血因子Ⅲ，主要存在于組織中的單核細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞［8］。TF釋放是血栓形成的始動(dòng)因素。炎性反應(yīng)損傷組織后引起TF釋放，從而激活凝血系統(tǒng)，導(dǎo)致微循環(huán)內(nèi)血栓形成，加重組織缺血缺氧［9］。

另一方面，心肌缺血再灌注過程中，血液流變學(xué)發(fā)生變化，使血液黏度增高和微循環(huán)內(nèi)血流瘀滯，致使血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，也導(dǎo)致TF合成釋放增加，誘發(fā)微循環(huán)內(nèi)血栓形成。由此可見，TF釋放在心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。眾多的研究都表明，心肌缺血再灌注過程中，血漿和局部組織中的 TF 水平均顯著升高［10，11］。

鑒于TF在心肌缺血再灌注損傷過程中起著重要作用，那么將TF作為靶標(biāo)，減少TF的合成與釋放是防治心肌缺血再灌注損傷的主要措施。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，將AODN用于阻斷TF基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)已有零星報(bào)道。AODN具有特異性強(qiáng)、安全性好、操作簡(jiǎn)單、所需劑量小的優(yōu)點(diǎn)［12］。Stephens等［13］在實(shí)驗(yàn)中觀察到，TF 的 AODN 能夠顯著抑制人單核細(xì)胞TF基因的轉(zhuǎn)錄，并減輕由單核細(xì)胞釋放TF而引起的炎性反應(yīng)。后來Nakamura等［3，4］都發(fā)現(xiàn)，大鼠TF的反義脫氧寡核苷酸能夠明顯減輕其肝、腎的缺血再灌注損傷，降低病死率。但是，Nakamura和Matsuyama都是將TF的反義脫氧寡核苷酸直接注射入大鼠體內(nèi)，AODN的長(zhǎng)度一般都在10～20個(gè)堿基，由于片段短，直接注射入體內(nèi)很容易被補(bǔ)體系統(tǒng)及各種酶所降解，不能穩(wěn)定地發(fā)揮作用，導(dǎo)致療效下降［14，15］。Lipofectamine能夠提高反義脫氧寡核苷酸的轉(zhuǎn)染效率，并延長(zhǎng)其在體內(nèi)的存在時(shí)間，但是它的毒性很大，因而限制了其在活體內(nèi)的進(jìn)一步應(yīng)用［16］。

隨著生物技術(shù)以及物理、化學(xué)等學(xué)科的迅猛發(fā)展，將納米技術(shù)應(yīng)用于醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域，開發(fā)納米級(jí)的分子作為基因轉(zhuǎn)移的載體用于攜帶AODN進(jìn)行基因治療已經(jīng)成為可能。PAMAM-D是一類新近開發(fā)出來的納米級(jí)基因轉(zhuǎn)移的載體。初步的研究結(jié)果表明，PAMAM-D能夠保護(hù)反義脫氧寡核苷酸不被血清或組織細(xì)胞中的補(bǔ)體及各種酶所破壞，而且效率明顯高于傳統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)移載體 Lipofectamine［17］。PAMAM-D屬于非生物材料，沒有免疫原性，不會(huì)引起機(jī)體的免疫反應(yīng);并且沒有遺傳毒性與細(xì)胞毒性，不會(huì)導(dǎo)致宿主的細(xì)胞轉(zhuǎn)化和細(xì)胞死亡［18］。本實(shí)驗(yàn)中我們應(yīng)用針對(duì)TF的反義寡脫氧核苷酸藕聯(lián)于G10代PAMAM-D納米載體，再將這一藕聯(lián)物注射入大鼠體內(nèi)，并結(jié)扎大鼠的冠狀動(dòng)脈左前降支，復(fù)制心肌缺血再灌注損傷的模型后，發(fā)現(xiàn)針對(duì)TF的反義寡脫氧核苷酸不僅抑制了TF的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，而且減少了過氧化脂質(zhì)產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生，也因此降低了SOD和GSH-PX減少的幅度，減輕了過氧化損傷。TnT和LDH是標(biāo)識(shí)心肌損傷的敏感指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)中針對(duì)TF的AODN由于減輕了過氧化損傷，因而也改善了缺血再灌注損傷導(dǎo)致的TnT和LDH水平升高。因而PAMAM-D納米載體介導(dǎo)的TF反義寡脫氧核苷酸對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷有明顯的防治作用。表明PAMAM-D納米載體介導(dǎo)的TF AODN通過拮抗TF，抑制心肌缺血再灌注損傷過程中的凝血系統(tǒng)激活，從而減輕大鼠心肌缺血再灌注過程中的脂質(zhì)過氧化損傷，對(duì)心肌缺血再灌注損傷有明顯的保護(hù)作用。有關(guān)PAMAM-D納米載體介導(dǎo)的TF AODN防治心肌缺血再灌注過程中脂質(zhì)過氧化損傷的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路還有待于深入研究。

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