徐 韜 徐先祥 林小鳳 吳雅清 許瑞安

福建省泉州市華僑大學(xué)分子藥物學(xué)研究所＆分子藥物教育部工程研究中心，福建 泉州 362021

隨著抗生素在臨床的廣泛使用，耐藥問(wèn)題也日益突出，尋找新的抗菌藥物或逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥已成為國(guó)際上研究的熱點(diǎn)。不少研究顯示中藥具有抗菌活性或逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥的作用，不少中藥具有抗菌活性，而且具有副作用小、很少發(fā)生耐藥現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn)［1］。賽霉安散由石膏、朱砂等藥組成，具有清熱止血、收斂祛濕、化腐生肌功效，臨床對(duì)于感染具有抗菌的效果［2］。本文從朱砂及石膏單味中藥入手，研究賽霉安的抑菌性能，為今后賽霉安的二次開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株

革蘭氏陽(yáng)性菌:金黃色葡萄球菌 (Staphyloccocus aureus Rosenbach)，非耐藥表皮葡萄球菌 (Methicillin sensitive Staphylococcus aureus)CMCC26069，枯草芽孢桿菌 (B acillus subtilis)。革蘭氏陰性菌:大腸埃希氏菌 (Escherichia coli)CMCC44825，銅綠假單孢桿菌 (Pseudomonas aeruginosa)CICC 10204，肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiella pneumoniae)CICC 10033，普通變形桿菌 (Proteus vulgaris)AS 1．1527，菌株購(gòu)自廣東省微生物種質(zhì)資源庫(kù)。

1.2 藥品

朱砂、石膏，由泉州亞泰制藥有限公司提供。左氧氟沙星，南陽(yáng)普康集團(tuán)衡淯制藥有限責(zé)任公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

TS 100倒置顯微鏡，Nikon公司。DHG－9076干燥箱，上海圣欣科學(xué)儀器公司。DHP－9052恒溫培養(yǎng)箱，上海圣欣科學(xué)儀器公司。恒溫震蕩培養(yǎng)箱，Thermo公司。

2 方法

2.1 菌液制備

取各菌種的凍存菌種活化，接種到含10 ml LB液體培養(yǎng)基的試管中，37℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，取100μl菌液接種到20μl LB固體培養(yǎng)基的平皿，培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落，10 ml LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜;取以上活化后菌液1ml作為菌懸液母液。

菌懸液a:吸取菌懸液母液50μl于950μl生理鹽水中混勻，計(jì)數(shù)后調(diào)節(jié)菌濃為106CFU/ml，用于抑菌圈測(cè)定。

菌懸液b:吸取菌懸液母液500μl，加入到10ml LB液體培養(yǎng)基中，計(jì)數(shù)后調(diào)節(jié)菌濃為106CFU/ml，用于最小抑菌濃度 (MIC)的測(cè)定。

2.2 抑菌圈測(cè)定

用無(wú)菌移液器吸取菌懸液a 100μl滴加于LB瓊脂培養(yǎng)基表面，用涂布棒涂布均勻，靜置5min后，每板放置經(jīng)高壓滅菌的牛津杯4個(gè)，放置5min，待菌液浸入且牛津杯吸附牢固后，每杯加100μl的各制備藥液，陰性對(duì)照杯為PH值調(diào)為7的模擬人工腸液，陽(yáng)性對(duì)照為左氧氟沙星。置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌圈直徑。

2.3 最小抑菌濃度 (MIC)的測(cè)定［4］

96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加100 μl菌懸液b，用PH值調(diào)為7的模擬人工腸液分別稀釋各藥品原制備液，采用二倍稀釋法分別稀釋至8個(gè)濃度梯度，分別加入到96孔板中，每孔100μl，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，測(cè)定最小抑菌濃度 (MIC)。加樣時(shí)，每列為一個(gè)藥濃度，第一列設(shè)為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基空白對(duì)照，第二列為左氧氟沙星陽(yáng)性對(duì)照，第三列為未加藥的空白菌對(duì)照。每行為同一菌種，自上而下依次為銅綠假單孢桿菌 (綠膿桿菌)、肺炎克雷伯氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、非耐藥表皮葡萄球菌、普通變形桿菌。

表1 測(cè)MIC試驗(yàn)中藥品稀釋終濃度 (mg/ml)

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 抑菌圈測(cè)定結(jié)果

朱砂可顯著抑制銅綠假單孢桿菌、肺炎克雷伯氏菌，抑菌圈直徑可達(dá)35mm以上;對(duì)于枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、非耐藥表皮葡萄球菌、普通變形桿菌具有較好的抑制效果，抑菌圈直徑范圍在12－20mm之間;對(duì)于大腸埃希氏菌，未檢測(cè)到抑制效果。且對(duì)于銅綠假單孢桿菌、枯草芽孢桿菌、非耐藥表皮葡萄球菌的抑制效果要好于陽(yáng)性對(duì)照。

石膏制備液對(duì)金黃色葡萄球菌、普通變形桿菌有抑制效果，但均不顯著，見(jiàn)表2。表中數(shù)據(jù)為受試菌抑菌圈的直徑(±s)mm。

表2 朱砂、石膏制備液抑菌效果

3.2 最小抑菌濃度 (MIC)的測(cè)定結(jié)果

微量倍比稀釋法測(cè)定朱砂與石膏制備液對(duì)各菌株的最小抑菌濃度 (MIC)，與抑菌圈的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比，朱砂與石膏制備液對(duì)各菌株的最小抑菌濃度具有與之類似的結(jié)果，朱砂制備液對(duì)于肺炎克雷伯氏菌以及銅綠假單孢桿菌有較好的抑制效果，MIC較其他菌種要低;石膏的制備液對(duì)于普通變形桿菌以及金葡菌有較弱的抑制效果，對(duì)于其他菌種基本無(wú)效。具體結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 朱砂、石膏最小抑菌濃度 (MIC)測(cè)定結(jié)果

4 討論

朱砂與石膏均為重要的傳統(tǒng)礦物中藥，兩種也是中藥復(fù)方賽霉安中主要藥物。朱砂外用具有清熱解毒功效，在胃腸道中可以溶出汞的各種含硫配合物［4］;石膏“生用不但能治病，且善于治瘡，且善于解毒”［5］。從本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出:朱砂體外對(duì)于傷口感染常見(jiàn)的菌種均有較好的抑制效果，以對(duì)肺炎克雷伯氏菌以及銅綠假單孢桿菌的抑制效果最為顯著，符合朱砂清熱解毒的功效特點(diǎn)。但石膏體外對(duì)于多數(shù)的受試菌株均無(wú)抑制效果，只對(duì)于普通變形桿菌以及金葡菌有較弱的抑制效果，其具體原因有待進(jìn)一步研究。由本文結(jié)果提示，可以考慮在控制朱砂用量以及其毒性的前提下，運(yùn)用君臣佐使的指導(dǎo)原則，適當(dāng)提高朱砂在重新組方的成藥中的比例，從而增強(qiáng)賽霉安的抑菌效果。

［1］蔡燕，邢艷，謝文光．中藥抗菌作用研究進(jìn)展［J］．中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011;8(6):9－10．

［2］江絮萍．賽霉安散局部治療在剖宮產(chǎn)術(shù)后切口感染28例效果觀察［J］．山東醫(yī)藥，2011;51(2):17．

［3］Soultos N，Tzikas Z，Christaki E，et al．The effect of dietary oregano essential oil on microbial growth of rabbit carcasses during refrigerated storage［J］．Meat Science，2009，81:474 －478．

［4］曾克武，王旗，楊曉達(dá)，等．朱砂溶出的體外研究［J］．中國(guó)中藥雜志，2007;32(3):231．

［5］王世民．石膏的外用方法［J］．山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008;9:426－27．