劉中柱,馬 可,劉艷姝,王 振,張 浩

(1.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院腎內科,黑龍江佳木斯 154003;2.一汽總醫(yī)院腎內科,吉林 長春 130013)

膜性腎病(MN)為免疫復合物形成和沉積于腎小球基底膜 (GBM)所致,由于 MN常合并高凝狀態(tài),腎小球內纖維蛋白沉積和微血栓形成,進一步加重 MN的 GBM改變,使尿蛋白增加,嚴重影響 MN的治療效果及預后[1]。轉化生長因子-β1(TGF-β1)的表達可作為反映 MN腎活檢組織腎小球硬化及腎間質纖維化的一個標志[2]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(BM P-7)在病理條件下亦參與了腎臟形態(tài)和功能的保護[3]。近年來不少實驗研究表明,BM P-7在各種急慢性腎病、血管鈣化的干預治療中均可發(fā)揮重要保護作用[4]。近年來人們對低分子肝素(LMW H)的藥理作用認識不斷深入,發(fā)現使用 LMW H治療 NS可減少尿蛋白,升高血漿蛋白,降低腎臟的纖維化。本實驗主要通過研究 LMWH對 MN大鼠尿蛋白的減少所發(fā)揮的作用,并探討 LMW H對大鼠腎組織中TGF-β1、BM P-7表達的影響及其可能的發(fā)生機制,從而對 MN的治療起到指導作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物模型的建立與分組

隨機將 40只大鼠隨機分為 4組,分別為空白對照組 (A組 )、模型組 (B組)、LMWH注射組 (C組)、厄貝沙坦喂養(yǎng)組(D組 ),每組 10只大鼠。各組大鼠均適應性喂養(yǎng) 1周,并定性檢測尿蛋白均為陰性。按文獻方法造模[7],B組、C組、D組大鼠均給與 C-BSA1mg溶于 0.5mL PBS中 ,與等量不完全弗氏佐劑充分混合乳化,在大鼠雙側腋下、腹股溝處作多點皮下注射進行預免疫。預免疫一周后,各組大鼠均由靜脈注射 C-BSA2.5mg,每周 3次 ,共注射 3周 ,制備 MN大鼠模型。于造模開始后第 2周即開始測定各組大鼠 24h尿蛋白,以后每隔一周采集尿液一次,分別記錄。LMW H注射組大鼠給予 LMW H300IU/100g? d,溶于 0.9%1mL生理鹽水中給大鼠進行皮下注射;厄貝沙坦喂養(yǎng)組大鼠給予厄貝沙坦50mg/kg每日清晨灌胃;空白對照組、模型組大鼠給與20mL/kg生理鹽水注射。以上藥物干預于第 3周末開始,共計 3周。于造模成功后第 6周末水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(共 24只,每組 6只 ),處死大鼠 ,取腎臟。

1.2 標本的收集與處理

1.2.1 小時尿蛋白定量測定

于造模開始后第 2周即開始由代謝籠收集各組大鼠 24h尿液,由生化測定儀測定各組大鼠 24h尿蛋白,以后每隔一周采集尿液一次,分別記錄。

1.2.2 病理學檢查

于造模成功后第 6周末 10%水合氯醛 0.35g/kg腹腔注射麻醉大鼠,迅速開腹,后以生理鹽水經腎動脈灌洗腎臟后取腎臟。固定部分腎臟組織進行 Masson染色。

1.2.3 Masson染色

石蠟切片,蒸鎦水洗 2次,鐵明礬 50℃下 20min,蒸鎦水洗 5次后蘇木素染色 5min,95%的乙酸洗 5次,飽和苦味酸溶液分化,自來水洗 10次。Ponceaus染色劑染色 2次,再 1%磷鉬酸分化 10次,1%醋酸洗 5次,阿尼林蘭對比染色,1%醋酸洗 5次,95%乙醇脫水,乙酸洗 3次,最后二甲苯透明,封片。

1.2.4 RT-PCR檢測

保存的腎臟組織固定于-70℃冰箱中 ,進行 RT-PCR測定。步驟如下:

從已知 Gen-Bank序列設計鼠 TGF-β1和 GAPDH引物。引物序列如下:TGF-β 1:上游引物 5'CAG TGG CTG AAC CAA GGA GAC3';下游引物 5'CGA CCC ACG T AG TAG ACG ATG 3';擴增產物為 500bp。 GAPDH:上游 5'CCA CAG TCC ATG CCA TCA CT 3';下游 5'GCC TGC TTC ACC ACC T TC TTG3';擴增片段為 268bp,TM值為61.8。

1.2.4.1 總 RN A提取:采用大連寶生物有限公司 Biozol試劑盒,嚴格按說明書操作。

1.2.4.2 反轉錄反應:在 Microtube管中配制下列混合液:dNTP Mixture 1μL,Oligo dT Primer1μL,Template RN A4 μL,5× Prime Script Buffer4μL,RNase Inhibitor 0.5μL.Prime Script RTase0.5 μL,RNase Free dH2O 9 μL,共計 20 μL。在 PCR儀上按下列條件進行反轉錄反應:42℃15～ 30min,95℃5 min。

1.2.4.3 PCR反應:按下列組成配制 PCR反應液:10×PCR Buffer5μL,dNTP Mixture2μL,上游引物 0.5μL,下游引物 0.5 μL,TaKaRa Ex Taq酶 0.5 μL,反轉錄反應液 5 μL,再加入 RNase Free dH2O使反應液達到 50 μL。在 PCR儀上按下列條件進行 PCR反應:94℃ 預變性 2min,94℃變性30s,55～ 65℃退火 30s,72℃引物延伸 lmin,循環(huán) 30次后72℃延伸 5min。

1.2.4.4 PCR產物電泳:1.5% 瓊脂糖凝膠制成厚度約為0.8cm瓊脂糖凝膠板,放入電泳槽。仔細將 5 μL PCR產物樣本與上樣緩沖液加入加樣槽 ,接通電源,電壓條件為 5V/cm。電泳 1h后紫外燈下觀察熒光帶 ,以 DN A marker為標準 ,并應用自動電泳凝膠分析系統對每一樣品 PCR產物擴增的特異性片段進行光密度掃描,并以特異擴增片段與 GAPDH條帶灰度值比值來表示其相對含量,分析電泳結果。

1.3 統計學處理

統計學分析運用 SPSS16.0軟件,所有指標均用平均數±標準差± s)表示,組間兩兩比較采用 q檢驗,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠尿蛋白的變化

治療 3周后 LMW H注射組、模型組、厄貝沙坦喂養(yǎng)組大鼠尿蛋白排泄量增多,較空白對照組大鼠尿蛋白排泄量有顯著差異 (P＜0.05),LMW H注射組與模型組大鼠尿蛋白排泄量相比顯著減少 (P＜0.05);LMW H注射組與厄貝沙坦喂養(yǎng)組大鼠相比,尿蛋白的排泄量沒有明顯差異(P＜0.05)。各組大鼠 24h尿蛋白排泄量的變化見 表1,圖 1。

表1 各組大鼠 24h尿蛋白排泄量的比較(±s,mg/24h)

表1 各組大鼠 24h尿蛋白排泄量的比較(±s,mg/24h)

注:*與正常對照組相比,P＜0.05;#與模型組相比,P＜0.05。

尿蛋白 A組 B組 C組 D組2周 3.012± 0.14613.029± 0.223* 10.665± 0.524*# 10.807± 0.207#*4周 5.362± 0.21619.529± 0.696* 18.165± 0.604*# 18.473± 0.431#*6周 6.511± 0.35923.862± 1.291* 21.331± 1.183*# 22.140± 1.661#*

2.2 LMW H對 MN大鼠腎臟 BMP-7免疫組織化學染色的影響

空白對照組大鼠腎臟間質出現陽性表達。 LMWH注射組、模型組、厄貝沙坦喂養(yǎng)組大鼠腎臟間質 BM P-7的表達較空白對照組 BM P-7的表達相比顯著減少 (P＜0.05);LMWH注射組與模型組大鼠腎臟間質 BMP-7的表達相比增多,差異有統計學意義 (P＜0.05);LMWH注射組與厄貝沙坦喂養(yǎng)組大鼠相比,沒有明顯差異 (P＞ 0.05)。見表2。

表2 各組大鼠腎臟 BM P-7免疫組化結果(±s,n=6)

表2 各組大鼠腎臟 BM P-7免疫組化結果(±s,n=6)

*與正常對照組相比,P＜0.05;#與模型組相比,P＜0.05。

組別 BM P-7 A組 0.377± 0.047 B組 0.122± 0.054*C組 0.267± 0.378*#D組 0.250± 0.045*#

2.3 低分子肝素對 MN大鼠腎臟組織 TGF-β 1mRN A表達的影響

治療 3周后低分子肝素注射組、模型組、厄貝沙坦喂養(yǎng)組大鼠腎臟組織 TGF-β1mRN A的表達與空白對照組TGF-β 1mRN A的表達相比明顯增多 (P＜0.05);低分子肝素注射組與模型組大鼠腎臟組織 TGF-β1mRNA的表達相比減少,差異有統計學意義 (P＜0.05);低分子肝素注射組與厄貝沙坦喂養(yǎng)組相比 ,沒有明顯差異 (P＞ 0.05)。說明低分子肝素注射治療 MN大鼠 3周后,可顯著降低腎組織中TGF-β1mRN A的表達。見表3。

表3 各組大鼠腎臟 TGF_β1mRN A表達的結果 ±s)

表3 各組大鼠腎臟 TGF_β1mRN A表達的結果 ±s)

注:*與正常對照組相比,P＜0.05;#與模型組相比,P＜0.05。

A組 B組 C組 D組T GF- β1mRN A 0.575±0.1091.268± 0.289* 0.819± 0.157*# 0.796±0.153*#

3 討論

本實驗采用 C-BSA方法建立大鼠 MN病模型,應用免疫組化方法觀察 BMP-7在腎組織中的表達情況。結果發(fā)現在大鼠正常腎組織中有著豐富的 BM P-7表達,在腎間質可見陽性染色,主要分布在腎小管和集合管。而模型組大鼠腎組織中 BMP-7表達顯著下降 (P＜0.05),提示 BM P-7可能在維持正常腎結構和功能方面發(fā)揮重要作用,而病變腎組織則會減少其表達。如前述,TGF-β 1的表達與之相反,在正常腎組織中表達甚少,而在病變腎組織中,其表達明顯增多 (P＜0.05)。上述結果表明 BM P-7確可制約 TGF-β 1的致纖維化作用,而 BM P-7蛋白表達下降很可能是 TGF-β 1mRNA表達上調促進纖維化形成的原因之一,但是其中具體作用機制尚不清楚,還有待于進一步研究。LMWH不僅具有抗凝、降尿蛋白及抗炎作用,更重要的是 LMW H還可抑制腎小球系膜細胞、上皮細胞、內皮細胞、腎小管上皮細胞及浸潤的單核細胞釋放出各種因子刺激系膜細胞增殖和基質增生[5]。大量的研究顯示應用 AngⅡ受體拮抗劑類(ARB)藥物除可特異性阻斷 AngⅡ而發(fā)揮降低蛋白尿和腎臟保護作用,還可間接減少 ECM積聚,,使腎臟的 TGF-β 1的基因表達接近正常,可有效的抑制腎臟組織細胞炎癥反應和腎臟纖維化及腎功能損害,發(fā)揮腎臟保護的作用。因此,本實驗以ARB治療 MN作為對比,以觀察 LMW H在 MN治療中的作用。本實驗結果提示,模型組大鼠 24h尿蛋白含量增多(P ＜0.05),而 LMWH治療后 ,大鼠 24h尿蛋白會明顯減少,說明 LMW H可有效減輕蛋白尿癥狀,可在一定程度上保護大鼠的腎臟功能。LMW H治療組大鼠腎組織中 TGF-β 1mRNA的表達明顯低于模型組大鼠腎組織中 TGF-β 1mRNA的表達,而腎間質 BM P-7的表達增加,提示LMWH可能通過增加 BM P-7的表達,抑制 TGF-β 1的致纖維化作用,降低腎小球的硬化及腎間質的纖維化,從而促進 MN早期緩解。雖然 LMW H注射組與厄貝沙坦喂養(yǎng)組相比,沒有統計學意義,但 LMW H治療 MN與厄貝沙坦比較,其用藥方便,皮下注射吸收率高,為一種安全有效的治療方法。

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