郝 燕 蘭會(huì)霞

(山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院微免教研室 山西 汾陽(yáng) 032200;①山西省汾陽(yáng)醫(yī)院)

HBeAg是一種可溶性的蛋白抗原，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為它是HB-cAg肽鏈被蛋白酶裂解產(chǎn)生的片段，是HBV在體內(nèi)復(fù)制的一個(gè)指標(biāo)，臨床醫(yī)生常根據(jù)HBeAg的陰陽(yáng)性來(lái)判斷患者是否具有傳染性，故其臨床意義顯著。因免疫學(xué)中酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)操作簡(jiǎn)便快捷，因此在大多數(shù)基層醫(yī)院用其來(lái)檢測(cè)乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。該法可以用目測(cè)法和酶標(biāo)儀來(lái)判斷結(jié)果，本文對(duì)這2種方法檢測(cè)HBeAg的結(jié)果進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清標(biāo)本。(1)標(biāo)本采集對(duì)象:樣本主要是在2010年6月之前山西醫(yī)科大學(xué)附屬汾陽(yáng)醫(yī)院檢驗(yàn)科采集的乙肝患者的血清，總共133例，均為漢族。(2)標(biāo)本采集方法:用真空采血管(不含抗凝劑)無(wú)菌采集患者清晨空腹肘靜脈血3～5mL，盡早分離新鮮血清，為避免反復(fù)凍融，以0.5mL每管分裝于1.5mL凍存管(Eppendorf管，以下簡(jiǎn)稱(chēng)EP管)中，做好標(biāo)記，于－70℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 診斷試劑盒和主要儀器 試劑盒購(gòu)自上海科華生物工程股份有限公司。檢測(cè)儀器為美國(guó)BIO－RAD 680酶標(biāo)儀。

1.2 操作方法 實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，實(shí)驗(yàn)原理為雙抗體夾心法。

1.2.1 設(shè)置空白對(duì)照孔1個(gè)、HBeAg陰性對(duì)照孔2個(gè)、陽(yáng)性對(duì)照2孔，空白孔不加樣品和酶結(jié)合物。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照孔分別加入陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照液各50μL，在其它反應(yīng)孔中各加入待檢標(biāo)本50μL。

1.2.2 每孔加入酶結(jié)合物50μL，在反應(yīng)板上加蓋封板膜，振蕩混勻，置37℃溫箱反應(yīng)30分鐘。時(shí)間到后棄去反應(yīng)液，每孔加入稀釋后的洗液300μL，靜置10秒，甩棄洗液，重復(fù)5次后拍干。每孔加入底物A、B液各50μL，加蓋封板膜，振蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。每孔加入終止液各50μL，振蕩混勻終止反應(yīng)。

1.2.3 結(jié)果判斷。目測(cè)記錄陽(yáng)性例數(shù)，當(dāng)顯色明顯高于HBeAg陰性對(duì)照的檢測(cè)孔判為陽(yáng)性，低于HBeAg陰性參比對(duì)照的檢測(cè)孔判為陰性。然后上酶標(biāo)儀檢測(cè)(事先輸入檢測(cè)的程序，設(shè)置好臨界值)，用空白對(duì)照孔調(diào)零，450nm測(cè)定各孔OD值，打印出結(jié)果，以確定目測(cè)法的可靠程度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0版統(tǒng)計(jì)軟件，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

目測(cè)法和酶標(biāo)儀判斷ELISA檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，目測(cè)法與常規(guī)ELISA檢測(cè)判定結(jié)果無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

表1 酶標(biāo)儀法和目測(cè)法判定ELISA檢測(cè)結(jié)果的比較

3 討論

ELISA是根據(jù)抗原抗體的特異性反應(yīng)的原理加上酶聯(lián)擴(kuò)大反應(yīng)信號(hào)而設(shè)計(jì)的，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢出率高等特點(diǎn)。但酶標(biāo)儀價(jià)格昂貴，要求操作者有一定的技能[1]，對(duì)目前很多偏遠(yuǎn)的以及一些基層醫(yī)院是不適用的。因此完全可以用目測(cè)法來(lái)代替酶標(biāo)儀來(lái)判斷HBeAg的陰陽(yáng)性。但是值得注意的是，ELISA測(cè)定中影響因素較多，操作中的各個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果影響較大[2]，一定要盡量注意操作的規(guī)范，避免假陽(yáng)性的出現(xiàn)，如:避免使用溶血的標(biāo)本;加樣以及加沖洗液時(shí)使用排槍可以避免反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致的假陽(yáng)性;加洗滌液時(shí)應(yīng)注滿(mǎn)孔但不可外溢;洗板時(shí)注意垂直甩洗液;加顯色劑后，應(yīng)按說(shuō)明書(shū)規(guī)定的時(shí)間內(nèi)判斷結(jié)果。觀(guān)測(cè)者應(yīng)注意顏色的對(duì)比，可置于白色背景下判斷顏色的深淺，可疑的患者標(biāo)本應(yīng)注意復(fù)查，這樣才能保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

[1]劉 慧，李春富，李菊升，等.目測(cè)法與酶標(biāo)儀判斷ELISA檢測(cè)旋毛蟲(chóng)病IgG的結(jié)果比較[J].中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2006，6(7):1177

[2]遲婉利，孔祥民.ELISA檢測(cè)乙肝病毒表面抗原假陽(yáng)性原因分析[J].中國(guó)誤診學(xué)雜志，2011，11(9):2050