宗兆文,張連陽(yáng),沈 岳,郭慶山,任永川,冉新澤,史春夢(mèng),程天民

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院/野戰(zhàn)外科研究所全軍戰(zhàn)創(chuàng)傷中心創(chuàng)傷科,重慶400042;2.第三軍醫(yī)大學(xué)全軍復(fù)合傷研究所國(guó)家創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室復(fù)合傷分室,重慶400038)

脊髓損傷(spinal cord injury)后的功能恢復(fù)是醫(yī)學(xué)研究的難點(diǎn)之一,其修復(fù)的主要策略包括減少脊髓損傷后的繼發(fā)性損傷,采用組織或細(xì)胞移植促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性變化以及應(yīng)用刺激神經(jīng)生長(zhǎng)的因子和(或)阻斷抑制軸突生長(zhǎng)的物質(zhì)以促進(jìn)受損軸突的再生等[1-2]。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是研究最為廣泛的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素之一,在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用廣泛而強(qiáng)大。大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí),BDNF可以保護(hù)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元,并可促進(jìn)紅核脊髓束和皮質(zhì)脊髓束軸突再生或出芽[3-4]。而干細(xì)胞移植被認(rèn)為是修復(fù)脊髓功能損傷最有前景的方法之一,本課題前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)真皮多能干細(xì)胞(dermal multipotent stem cell,dMSCs)可在體外被誘導(dǎo)為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞[5-7],其他學(xué)者也證實(shí)dMSCs移植后可促進(jìn)脊髓損傷后的功能恢復(fù)[8]。為了同時(shí)發(fā)揮dMSCs和BDNF的修復(fù)效果,本研究觀察了BDNF腺病毒表達(dá)載體(adenovirus vector of BDNF,Adv-BDNF)感染的dMSCs移植后對(duì)脊髓損傷的修復(fù)效果,報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和主要試劑 Wistar大鼠購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動(dòng)物所。Adv-BDNF由本實(shí)驗(yàn)室張正豐博士構(gòu)建并饋贈(zèng)。兔抗鼠BDNF多克隆抗體和異硫氰酸熒光素(fluoresceine isothiocyanate,FITC)結(jié)合的第二抗體購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。免疫組化試劑盒購(gòu)自Boster公司。細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)基及血清等購(gòu)自Hyclone公司。

1.2 dMSCs的分離培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 參照本研究所建立的早期貼壁法進(jìn)行dMSCs的分離培養(yǎng)和鑒定[9]。方法簡(jiǎn)述如下:新生1 d Wistar大鼠,引頸處死,乙醇消毒,剪取皮膚置于0.25%胰酶消化過夜;次日,用磷酸緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS)清洗,去除表皮和皮下組織,將真皮組織剪成細(xì)胞碎片并吹打成細(xì)胞懸液,過濾并接種于培養(yǎng)瓶中;6 h后,棄培養(yǎng)液和懸浮細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)早期貼壁細(xì)胞;反復(fù)傳代至有集落樣細(xì)胞群體產(chǎn)生,按常規(guī)方法接種和選取細(xì)胞克隆,傳代備用;dMSCs移植前4 h向其培養(yǎng)基中加入0.2 mL第3代Adv-BDNF病毒原液(病毒滴度約為1.5×1010PFU/mL,PFU為plaque-forming unit,即空斑形成單位);繼續(xù)培養(yǎng)4 h后收集dMSCs,制成濃度為 1×107/mL的細(xì)胞懸液,備用。

1.3 建模、細(xì)胞移植與分組 成年Wistar大鼠72只采用改良Allen重物打擊法制作脊髓損傷模型[10],方法簡(jiǎn)述如下:將麻醉后的大鼠俯臥位固定,顯露T10節(jié)段脊髓,用質(zhì)量20 g、打擊頭直徑2.5 mm的打擊器自2.5 cm高處自由落下,造成T10節(jié)段脊髓打擊傷。受傷大鼠隨機(jī)分為 A、B、C、D四組:A組接受Adv-BDNF感染的dMSCs移植(n=18),將 100 μ L感染Adv-BDNF的dM SCs懸液緩慢用微量注射器注入損傷脊髓處,注射完畢留針5 min以防細(xì)胞滲漏。B組接受未感染Adv-BDNF的 dMSCs移植(n=18)。C組接受單純 Adv-BDNF注射(n=18)。D組為單純脊髓損傷(n=18)。其中,B、C組的注射方式、部位、細(xì)胞密度及液體用量與A組相同。為防止膀胱感染,術(shù)后人工擠壓膀胱排尿,2次/天。

1.4 免疫熒光組織化學(xué)檢測(cè) 細(xì)胞移植后3 d和7 d,每組取6只大鼠引頸處死后取材,95%乙醇固定,常規(guī)制備5 μ m厚的脊髓石蠟切片,PBS漂洗3次,血清封閉后加兔抗鼠BDNF多克隆抗體,4℃孵育過夜。PBS漂洗3次后加熒光第二抗體,室溫孵育1 h。熒光顯微鏡觀察。

1.5 損傷脊髓局部凋亡細(xì)胞檢測(cè) 取傷后3 d大鼠脊髓,每組6只,常規(guī)消化、離心,冷PBS洗細(xì)胞 2次,加入預(yù)冷70%乙醇,4℃固定過夜。離心收集細(xì)胞,以1 mL的PBS洗滌細(xì)胞1次,加入 500 μ L 含 50 μ g/mL 溴 化乙錠 、100 μ g/mL RNA 酶A、0.2%Triton X-100的PBS,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞的百分比。

1.6 行為學(xué)檢測(cè) 傷后7 d采用BBB(Basso,Beattie and Bresnahan locomotor rating scale)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分法評(píng)定大鼠的功能恢復(fù)情況[11-12],功能評(píng)價(jià)完畢,取材進(jìn)行上述1.4步驟的免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料用±s表示,t檢驗(yàn)進(jìn)行組間分析,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 脊髓損傷后大鼠脊髓中BDNF的表達(dá) BDNF陽(yáng)性細(xì)胞呈綠色熒光。A組大鼠損傷的脊髓中有大量較強(qiáng)的綠色熒光,為BDNF陽(yáng)性細(xì)胞,大部分呈長(zhǎng)梭狀,少數(shù)為神經(jīng)元樣細(xì)胞(封2圖1 A),提示大部分BDNF陽(yáng)性細(xì)胞為dMSCs,其余可能為少數(shù)dM SCs壞死崩解后釋放病毒感染脊髓損傷局部的神經(jīng)元或脊髓損傷引起局部反應(yīng)而出現(xiàn)神經(jīng)元BDNF的陽(yáng)性表達(dá)。C組大鼠局部可見大量BDNF陽(yáng)性細(xì)胞,多為神經(jīng)元形狀(封2圖1 C),提示Adv-BDNF局部注射可有效地感染脊髓損傷局部的神經(jīng)細(xì)胞。B組和D組脊髓損傷局部BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯稀少(封2圖1 B、D)。傷后 7 d,A組和C組大鼠脊髓損傷局部BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量無明顯減少,B組和D組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量也無明顯變化。

圖2 脊髓損傷7 d大鼠的BBB神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分

2.2 脊髓損傷后大鼠脊髓中細(xì)胞的凋亡 脊髓損傷急性期(1～3 d)為局部細(xì)胞凋亡的高峰期,因此,本研究觀察脊髓損傷3 d時(shí)細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果顯示A組大鼠脊髓損傷局部細(xì)胞的凋亡率為(4.7±0.4)%,略低于C組(4.9±0.3)%,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),但其明顯低于 B組[(6.2±0.4)%](P＜0.05)和D組[(6.7±0.5)%](P＜0.05)。

2.3 BBB神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分法對(duì)大鼠神經(jīng)功能的評(píng)價(jià) 傷后7 d A組大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)最好,明顯優(yōu)于其他各組(P＜0.05);B組和C組大鼠功能恢復(fù)相當(dāng),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),但二者均高于 D組(P＜0.05)。見圖2。

3 討 論

干細(xì)胞移植被認(rèn)為是修復(fù)脊髓損傷最有前景的方法之一。相對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞,皮膚來源的干細(xì)胞移植具有取材方便、來源豐富、可進(jìn)行自體移植等諸多優(yōu)點(diǎn)。目前,已經(jīng)從真皮中分離到包括dMSCs、皮膚源性前體細(xì)胞等多種干細(xì)胞,均可在適當(dāng)?shù)臈l件下被誘導(dǎo)為神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞,移植后可促進(jìn)損傷的脊髓神經(jīng)功能恢復(fù)[8,13-14]。本研究的前期實(shí)驗(yàn)顯示,dMSCs在體外可被誘導(dǎo)為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞,提示dMSCs可作為修復(fù)脊髓損傷的合適選擇。

使用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素是修復(fù)脊髓損傷的另一策略。BDNF是目前被證實(shí)的作用最強(qiáng)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,可促進(jìn)神經(jīng)元的存活以及受損紅核脊髓束和皮質(zhì)脊髓束軸突的再生或出芽[3-4],在脊髓損傷的修復(fù)中具有重要作用。為了同時(shí)發(fā)揮BDNF和dMSCs的作用,本研究采用腺病毒感染的方法用BDNF基因修飾dMSCs,然后將其移植到脊髓損傷局部,結(jié)果表明較單純dMSCs移植和單純BDNF基因修飾,接受Adv-BDNF感染的dMSCs移植能更好地促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。

本研究初步探討了BDNF基因修飾dMSCs的移植對(duì)脊髓損傷的修復(fù)作用。結(jié)果表明BDNF基因修飾可減少脊髓損傷局部細(xì)胞的凋亡,對(duì)脊髓損傷后的二次損傷具有一定的預(yù)防作用。而dMSCs的作用可能不是通過減少局部細(xì)胞的凋亡來實(shí)現(xiàn),因?yàn)閱渭僤MSCs移植組脊髓損傷局部細(xì)胞的凋亡率高于單純BDNF修飾組,但兩組大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)并無顯著差異,提示dMSCs對(duì)損傷脊髓功能恢復(fù)的促進(jìn)還可能存在其他機(jī)制,如dMSCs在脊髓損傷局部分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞而參與損傷修復(fù)。BDNF基因修飾dMSCs移植還可能通過保護(hù)大腦皮層的投射神經(jīng)元(如皮質(zhì)脊髓束),使其免于細(xì)胞凋亡以及促進(jìn)損傷軸突的再生[15],從而達(dá)到修復(fù)損傷的目的。這些可能機(jī)制還需進(jìn)一步深入探討。

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