潘高峰 毛善平 張 乾 董慧敏 嚴(yán)明敏 付志平 李 燕

自上世紀(jì)90年代初以來(lái),雌激素在防治阿爾茨海默病(A lzheimer's disease,AD)的作用就一直受到人們的關(guān)注,但是雌激素易誘發(fā)乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌及靜脈血栓等副作用,因此限制了雌激素在防治AD中的臨床應(yīng)用。植物雌激素是從植物當(dāng)中發(fā)現(xiàn)的具有雌激素樣作用的物質(zhì),與雌激素相比更安全,例如白藜蘆醇、大豆異黃酮及亞麻木酚素等。α-玉米赤霉醇是一種新型的植物雌激素,為一種選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑,同時(shí)具有雌激素樣效應(yīng)和抗雌激素樣效應(yīng)[1-4],其在防治AD方面尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用轉(zhuǎn)APP基因構(gòu)建AD小鼠模型,應(yīng)用α-ZAL治療后,觀察小鼠的行為學(xué)改變以及血清和腦組織中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醇(MDA)含量,以明確α-ZA L在防治阿爾茨海默病的作用以及作用機(jī)制,為臨床應(yīng)用α-ZAL防治AD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1 試劑與藥物 α-ZA L(純度≥98%)購(gòu)買自sigma公司,超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)及微量丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 M orris水迷宮購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所,UV-7501紫外分光光度儀購(gòu)自無(wú)錫科達(dá)儀器廠,RT-1904C生化分析儀由深圳雷杜科技有限公司提供

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 9月齡轉(zhuǎn)APP基因小鼠14只,體重(50±5)g,購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司(質(zhì)量合格證號(hào)：0187171,使用證號(hào)：00014980),9月齡健康與轉(zhuǎn)APP基因小鼠遺傳背景相同的C57BL/6J系正常小鼠7只,體重(50±5)g,北京華阜康生物科技股份有限公司(質(zhì)量合格證號(hào)：0203284,使用合格證號(hào)：00014980)。

1.4 動(dòng)物分組及給藥 9月齡轉(zhuǎn)APP基因小鼠按照體重、性別和M orris水迷宮測(cè)試成績(jī)分層后隨即分為2組：模型組、α-ZAL治療組,每組7只,另選7只9月齡健康與轉(zhuǎn)APP基因小鼠遺傳背景相同的C57BL/6系正常小鼠按性別、體重及M orris水迷宮測(cè)試成績(jī)組成正常對(duì)照組。α-ZA L治療組從9月齡開(kāi)始時(shí)分別灌胃給予溶于植物油的α-ZA L 1.0 mg?(kg-1?d-1,連續(xù)40天 。模型組和對(duì)照組灌胃等量的植物油連續(xù)40 d。

1.5 試驗(yàn) 水迷宮由圓形水池、圖像采集系統(tǒng)以及操作分析系統(tǒng)組成。水池直徑150 cm,高45 cm,水深32 cm。在一個(gè)象限內(nèi)放置1個(gè)直徑為5.5 cm,高30 cm的平臺(tái),水溫保持在25℃左右,平臺(tái)、水、池壁均染黑以隱蔽平臺(tái),水池周圍有固定的參照線索供小鼠定位平臺(tái)。攝像機(jī)裝于水池上方約3 m處,并與監(jiān)視器和計(jì)算機(jī)相連。(1)定位航行實(shí)驗(yàn)：給藥40 d后開(kāi)始檢測(cè)3組動(dòng)物隱匿平臺(tái)逃避潛伏期。實(shí)驗(yàn)歷時(shí)5 d,隨機(jī)從4個(gè)不同象限入水,記錄小鼠從入水至爬上平臺(tái)的時(shí)間,即隱匿平臺(tái)逃避潛伏期。爬上平臺(tái)后停留10 s,超過(guò)60 s的記為60 s,每天進(jìn)行1次。隱匿平臺(tái)逃避潛伏期反映空間學(xué)習(xí)記憶能力;(2)空間探索實(shí)驗(yàn)：第6 d上午撤出平臺(tái),將小鼠隨機(jī)從某一象限池壁中點(diǎn)面向池壁放入水中,記錄60 s內(nèi)穿越平臺(tái)部位的次數(shù)。

1.6 血清和腦組織中SOD、GSH-PX活力和MDA含量的測(cè)定 各組小鼠脫頸處死,眼球取血,離心(3 000 r/min,10 min),分離血清置4℃?zhèn)溆?斷頭摘全腦以冰冷生理鹽水清理血跡,用濾紙吸干,稱質(zhì)量,加入19倍冰冷生理鹽水手動(dòng)制成5%腦勻漿,離心(2 500 r/m in,10 m in),取上清液置4℃?zhèn)溆?。GSH-PX、SOD活力和MDA含量測(cè)定應(yīng)用自動(dòng)生化分析儀和紫外分光光度計(jì)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS16.0軟件。計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用方差分析,兩兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為有顯著性差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 α-ZA L對(duì)轉(zhuǎn)APP基因小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

2.1.1 定位航行試驗(yàn) 3組小鼠從水迷宮訓(xùn)練第1 d開(kāi)始,模型組的逃避潛伏期較正常對(duì)照組明顯延長(zhǎng)(P＜0.01),且隨著訓(xùn)練天數(shù)的延長(zhǎng)差異更趨于穩(wěn)定。α-ZA L治療組與模型組隨著時(shí)間推移可見(jiàn)有明顯差異(P＜0.05),尤其在第4d開(kāi)始就有顯著性差異(P＜0.01)。3組小鼠隨著訓(xùn)練次數(shù)增多,尋找平臺(tái)的時(shí)間也在縮短,說(shuō)明學(xué)習(xí)鍛煉可以增強(qiáng)空間學(xué)習(xí)記憶能力,但各組小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力有差異(表1)。

表1 3組逃避潛伏期變化(±s,s)

表1 3組逃避潛伏期變化(±s,s)

注：與正常對(duì)照組比較﹡P＜0.05,﹡﹡P＜0.01;與模型組比較﹟P＜0.05,﹟﹟P＜0.01

組別逃避潛伏期第1 d 第2 d 第3 d 第4 d 第5 d模型組 57.29±3.75﹡﹡ 46.12±5.29﹡﹡ 37.49±6.01﹡﹡ 32.23±5.66﹡﹡ 27.23±6.76﹡﹡α-ZAL治療組 47.21±7.45 34.53±7.27﹟ 25.04±8.32﹟ 18.29±7.36﹟﹟ 13.35±6.06﹟﹟正常對(duì)照組 42.93±5.79 29.56±3.41 19.76±6.03 14.40±4.67 8.16±2.62

2.1.2 空間探索實(shí)驗(yàn) 模型組與正常對(duì)照組之間比較差別有顯著性差異(P＜0.05),α-ZAL治療組與模型組之間穿越平臺(tái)的次數(shù)比較差別有顯著性差異(P＜0.05)(表2)。

表2 3組空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較(±s,s)

表2 3組空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較(±s,s)

注：與正常對(duì)照組比較,﹡P＜0.05;與模型組比較,﹟P＜0.05

組別 只數(shù) 60 s越平臺(tái)的次數(shù)模型組 7 1.71±0.76﹡α-ZA L治療組 7 3.86±1.07﹟正常對(duì)照組 7 4.43±1.13

2.2 小鼠血清中SOD、GSH-PX活性和MDA含量的測(cè)定 α-ZAL治療組SOD、GSH-PX活性明顯高于模型組,MDA含量明顯低于模型組,均有顯著性差異(P＜0.01)。正常對(duì)照組SOD、GSH-PX活性明顯高于模型組,MDA含量明顯低于模型組,差別有高度顯著性差異(P＜0.01)(表3)。

表3 3組小鼠血清中SOD、GSH-PX活性和 M DA 含量比較(±s,s)

表3 3組小鼠血清中SOD、GSH-PX活性和 M DA 含量比較(±s,s)

注：與正常對(duì)照組比較﹡P＜0.01;與模型組比較﹟P＜0.01

組別 n GSH-PX/(U/m L)SOD/(U/m L)MDA/(nmo l/L)模型組 7 172.85±24.36﹡ 89.47±12.75﹡ 11.43±1.25﹡α-ZA L治療組 7 261.39±9.37# 128.98±13.28# 6.50±0.73#正常對(duì)照組 7 279.81±8.99 134.17±15.70 5.35±0.47

2.3 小鼠腦組織中SOD、GSH-PX活性和MDA含量的測(cè)定 與正常對(duì)照組比較,模型組腦組織中SOD、GSH-PX活性活性下降、MDA含量增高(P＜0.01)。與模型組比較,α-ZAL治療組 SOD、GSHPX活性活性增高、MDA含量降低,有顯著性差異(P＜0.01)(表4)。

表4 3組小鼠腦組織中SOD、GSH-PX活性和 M DA 含量比較(±s,s)

表4 3組小鼠腦組織中SOD、GSH-PX活性和 M DA 含量比較(±s,s)

注：與正常對(duì)照組比較﹡P＜0.01;與模型組比較﹟P＜0.01

組別 n GSH-PX/(U/m L)SOD/(U/mL)M DA/(nmol/L)模型組 7 10.72±0.66﹡ 72.05±10.03﹡ 18.05±1.52﹡α-ZA L治療組 7 18.99±3.40# 100.92±13.90#10.45±1.48#正常對(duì)照組 7 20.60±0.62 107.49±15.45 8.89±1.51

3 討 論

阿爾茨海默病是老年期以漸進(jìn)性記憶力和智能減退為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,1906年由德國(guó)精神病學(xué)家A lois A lzheimer首次報(bào)道[5]。其臨床特點(diǎn)為記憶障礙、認(rèn)知障礙和精神異常等癥狀,病情呈進(jìn)行性加重,逐漸喪失獨(dú)立生活能力,最終多因并發(fā)感染而死亡。近一個(gè)世紀(jì)人們對(duì)AD進(jìn)行了大量的研究,但由于AD的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,因此迄今為止,對(duì)于AD的有效的防治措施還遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒(méi)有解決。AD顯著病理學(xué)特征為大腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)細(xì)胞外出現(xiàn)β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein,Aβ沉積形成老年斑(senile p laques,SP)、腦神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)tau蛋白異常磷酸化聚集形成神經(jīng)元纖維結(jié)(neurofibrillary tangles,NFTs)和選擇性神經(jīng)元缺失和突觸改變。國(guó)內(nèi)外大量實(shí)驗(yàn)研究表明,自由基引起氧化損傷是不同病因誘發(fā)神經(jīng)退行性改變的最終的共同通路,氧化應(yīng)激參與了AD的病理過(guò)程[6]。活性氧(ROS)是體內(nèi)重要的自由基,它來(lái)源于線粒體磷酸化時(shí)分子氧到水的減少過(guò)程中,雙分子氧減少的結(jié)果產(chǎn)生超氧陰離子(O?2-)、過(guò)氧化氫(H2O2)和羥基自由基(?OH),大量的自由基未能被清除,則損傷生物大分子包括蛋白質(zhì)、DNA和脂質(zhì)過(guò)氧化,致使神經(jīng)細(xì)胞凋亡進(jìn)而導(dǎo)致或加重AD[7]。神經(jīng)細(xì)胞的減少和缺失是導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶障礙的主要因素,MDA是自由基攻擊機(jī)體產(chǎn)生的終產(chǎn)物之一,因此測(cè)定MDA的含量常?？梢苑从硻C(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的程度。GSH-PX和SOD是機(jī)體內(nèi)清除自由基的關(guān)鍵酶,它們可以保護(hù)機(jī)體不受自由基的損傷,對(duì)它們的監(jiān)測(cè)可以反映出機(jī)體抗氧化能力的強(qiáng)弱。本實(shí)驗(yàn)使用的轉(zhuǎn)APP基因構(gòu)建AD小鼠模型已得到公認(rèn),同時(shí)為了消除內(nèi)源性雌激素對(duì)本實(shí)驗(yàn)的影響從而選擇了9月齡小鼠并按性別進(jìn)行配對(duì)分組。結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組比較,轉(zhuǎn)APP基因模型組空間學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降,血清和腦組織中的GSPPX和SOD的活力降低,MDA的含量升高(P＜0.01),說(shuō)明氧化應(yīng)激參與了AD的病理過(guò)程。

α-ZAL是玉米赤霉烯酮的還原產(chǎn)物。1962年Stob等首先報(bào)道玉米赤霉醇的培養(yǎng)基中分離出這用物質(zhì),證明具有雌激素樣效應(yīng),可刺激小白鼠子宮增重,并可促進(jìn)肉用牛羊增重而無(wú)可覺(jué)察的副作用。目前作為一種新型的植物雌激素藥物,α-ZA L已經(jīng)受到人們的廣泛關(guān)注。在心血管疾病實(shí)驗(yàn)研究中證實(shí)α-ZAL可以增強(qiáng)超氧化物歧化酶(SOD)活性,加速H2O2和超氧陰離子的清除,減輕氧化應(yīng)激損傷[8]。本實(shí)驗(yàn)早期給予轉(zhuǎn)APP基因AD模型小鼠α-ZAL,其結(jié)果顯示：α-ZAL對(duì) AD模型小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力有一定的保護(hù)作用,能增強(qiáng)GSH-PX和SOD活性,同時(shí)能有效清除體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的代謝物MDA,降低腦組織NO含量,提高了機(jī)體的抗氧化能力。由此可以推斷α-ZAL可以用來(lái)早期干預(yù)或預(yù)防AD,改善患者的認(rèn)知、記憶等臨床癥狀。其機(jī)制可能在于α-ZAL增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力,保護(hù)了神經(jīng)細(xì)胞,減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

AD的發(fā)生是一個(gè)長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)性進(jìn)展的過(guò)程,因此實(shí)驗(yàn)必需要有較長(zhǎng)時(shí)間的觀察才有可能獲得更準(zhǔn)確的結(jié)論。本實(shí)驗(yàn)為防治AD臨床藥物開(kāi)發(fā)提供了有價(jià)值的參考依據(jù),但是要獲得更全面的信息還需要進(jìn)行大量實(shí)驗(yàn)研究。相信隨著研究的深入,α-ZAL作為一種新型的植物雌激素憑借其自身優(yōu)勢(shì)在防治AD等方面的應(yīng)用會(huì)得到良好的發(fā)展。

1 戴順齡,段金虹,陸 媛,等.α玉米赤霉醇——一個(gè)值得重視的新的植物雌激素.中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志,2005,13(5)：670-672.

2 孫海燕,劉 舒,呂樹(shù)錚,等.植物雌激素對(duì)心血管保護(hù)作用的研究進(jìn)展.臨床薈萃,2005,20(7)：414-416.

3 Dai S.Phy toestrogen alpha-zearalanol inhibits atherogenesis and im proves lipid profile in ovariectom ized cholesterol-fed rabbits.Endocrine,2004,25(2)：121-129.

4 李少春,程 煒,段 斐,等.α-玉米赤霉醇對(duì)去卵巢大鼠骨生物力學(xué)的影響.醫(yī)學(xué)研究與教育,2010,27(3)：6-8.

5 Ni Y.Activation of beta2-adrenergic receptor stimu latesgammasecretase activity and accelerates amy loid plaque formation.Nat Med,2006,12(12)：1390-1396.

6 Ch risten Y.Oxidative stress and A lzheimer disease.Am JClin Nutr,2000,71(2)：621-629.

7 于如同,李 祥,高立達(dá),等.氧化應(yīng)激誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡與 c-M yc、Fas-FasL、核因子-κB關(guān)系的研究.中華創(chuàng)傷雜志,2003,19(6)：344-347.

8 王 雯,邱笑違,蔣東橋,等.植物雌激素α-玉米赤霉醇對(duì) HUVEC低氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用.中國(guó)病理生理雜志,2006,22(11)：2110-2112.