鄭紅云 李 艷 童永清

促進軸突生成不僅可以阻止AD患者腦中神經(jīng)元軸突退行性變,而且還有可能促進退變軸突的再生。神經(jīng)元極性是指絕大多數(shù)神經(jīng)元存在一個長的軸突和幾個短的樹突。胎鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)是研究神經(jīng)元極性的良好模型[1,2]。培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元的突起中一個突起發(fā)展成為長的軸突,剩下的突起則形成短的樹突[3]。神經(jīng)元發(fā)生發(fā)展到最后成熟需要經(jīng)歷6個階段[4]：神經(jīng)元自圓形細胞球開始,胞體周圍開始伸出偽足(培養(yǎng)4 h),之后偽足逐漸形成小的突起(培養(yǎng)12～24 h),神經(jīng)元突起繼續(xù)生長,眾多突起中有一個突起迅速生長成為軸突時,我們稱該神經(jīng)元極性已經(jīng)形成(培養(yǎng)24～48 h)。因此,神經(jīng)元極性形成的標志就是其軸突的生成。雖然軸突的運輸模式及其正常的生理功能已經(jīng)被研究得較為清楚,但有關神經(jīng)元軸突生成的相關機制還知之甚少。

調(diào)節(jié)微管的腦衰反應調(diào)節(jié)蛋白2(CRMP-2)廣泛高表達于發(fā)育神經(jīng)系統(tǒng),是CRMP家族5種亞型之一[5]。海馬神經(jīng)元處于生長狀態(tài)的軸突含有豐富的CRMP-2,其在軸突生長錐中主要以非磷酸化CRMP-2活性形式存在[5]。國外研究發(fā)現(xiàn),CRMP-2與管蛋白異二聚體相互作用而促進微管的聚集[6];CRMP-2通過與Numb以及重組肌絲的相互作用調(diào)節(jié)某些特異的黏附分子如 L1的內(nèi)吞[7];CRMP-2可以與驅(qū)動蛋白-1輕鏈作用而將管蛋白異二聚體或Sra-1連接至驅(qū)動蛋白-1(Kinesin-1),然后CRMP-2/Kinesin-1復合物可以將管蛋白等運輸?shù)捷S突遠端[8],但國內(nèi)有關CRMP-2與軸突生長的關系尚無相關研究。

本實驗以原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)為研究模型,通過轉(zhuǎn)染野生型或失活型CRMP-2質(zhì)粒處理極性形成早期的神經(jīng)元,探討CRMP-2對海馬神經(jīng)元軸突生長的影響,為神經(jīng)元極性形成機制提供新的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 動物 孕18 d的SD大白鼠30只(由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物學部提供)。

1.2 試劑及抗體 DMSO購于sigm a公司。羊抗EGFP、鼠抗 DsRed均購自 Abcam(Cambridge,MA)、Tau-1抗體購自M illipore(Temecula,CA);Amaxa大鼠神經(jīng)元核電轉(zhuǎn)試劑盒(Rat Neuron Nucleofector Kit)購自 Lonza(Cologne,Germany);Rhodamine Red-X-,Oregon Green 488購自M olecular Probes(Eugene,OR,USA)。

1.3 質(zhì)粒來源 The wild-type CRMP2(EGFP-w tCRM P2)and EGFP-T514D CRM P2突變體由美國Dr.K.Kaibuchi饋贈。

1.4 原代海馬神經(jīng)元細胞培養(yǎng) 無菌條件下取出孕18 d胎鼠的完整腦組織,剔除腦膜和血管,鈍性分離出雙側海馬;將海馬剪成1mm3的組織塊(以上均在冰上進行),置入解剖液(含3-6%葡萄糖DHanks)中,0.125%胰蛋白酶(Gibco,USA)37℃消化15min,加入種植培養(yǎng)液(含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)終止反應,滴管吹打后經(jīng)200目篩網(wǎng)濾過,1500r/min離心5m in,加入適當?shù)姆N植培養(yǎng)液重懸,細胞計數(shù),調(diào)至1×107/L,接種于預鋪多聚賴氨酸的培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);4h后換成維持培養(yǎng)基(1%Glutamate/2%B27/97%Neurobasalmedia)。

1.5 免疫熒光雙標標記 處理細胞吸出培養(yǎng)基,PBS漂洗后加入4%多聚甲醛常溫固定15～20 min;PBS-0.1%Triton漂洗,然后PBS-0.5%Triton破膜5～10min,PBS-0.1%Triton漂洗,5%BSA封閉1 h,分別滴加羊抗 EGFP(1∶200)、兔抗DsRed(1∶1000)和鼠抗Tau-1(1∶200),于4℃孵育過夜,漂洗后分別加入熒光標記抗于室溫孵育1 h,漂洗后50%甘油封片,于雙光子共聚焦顯微鏡下觀察。

1.6 核電轉(zhuǎn)技術 原代海馬神經(jīng)元轉(zhuǎn)染率較低,為了得到比較高的轉(zhuǎn)染效率,我們選用了Amaxa Biosysterms公司 NucleofectorⅡ電轉(zhuǎn)儀以及 Rat Neuron Nucleofector Kit對剛分離的海馬神經(jīng)元進行核轉(zhuǎn)染。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件,全部數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標準差(±s)表示;采用Image-Prop lus軟件統(tǒng)計突起長度。

2 結 果

2.1 CRM P-2促進極性建立期原代海馬神經(jīng)元軸突的生長

原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)24h后采用核電轉(zhuǎn)實驗分別轉(zhuǎn)染 EGFP,w tCRM P2[9]和失活型 T514DCRMP2(突變體,模擬磷酸化失活型CRMP-2)[9];第3 d檢測CRMP-2對神經(jīng)元軸突生長的影響;培養(yǎng)72 h固定做熒光三標,分別標記EGFP和軸突標志物Tau-1。轉(zhuǎn)染EGFP載體對照組神經(jīng)元正常發(fā)育,培養(yǎng)至48 h,神經(jīng)元軸突特異性表達標志物蛋白Tau-1(圖1A,右側為局部放大圖)。過表達了野生型CRMP-2的神經(jīng)元除了生成一條長的特異性表達Tau-1的軸突(圖1B,局部放大1)外,另外一條突起也發(fā)育成了特異性表達Tau-1的軸突(圖1B,局部放大2);而過表達了失活型CRMP-2的神經(jīng)元發(fā)育與正常組相比無差異(圖1C),過表達了w t-CRMP-2的神經(jīng)元平均軸突長度、軸突數(shù)目及多軸突神經(jīng)元所占比例均明顯增加,而失活型CRMP-2影響不大(圖1D～1F)。

2.2 各組平均軸突長度、軸突數(shù)目和軸突所占比例

對照組平均軸突長度為185.4μm、軸突數(shù)目為1.1、軸突所占比例為10%;過表達野生型CRMP-2神經(jīng)元平均軸突長度為250.3μm、軸突數(shù)目為2.1、軸突所占比例為40%;而轉(zhuǎn)染突變體CRMP-2的神經(jīng)元神經(jīng)元平均軸突長度為180.0μm、軸突數(shù)目為0.9、軸突所占比例為9%(表1)。

圖1 CRM P-2對神經(jīng)元軸突生長的影響

表1 分別轉(zhuǎn)染w tCRMP-2和突變體CRM P-2對神經(jīng)元軸突長度和數(shù)目的影響

3 討 論

軸突生成是神經(jīng)元發(fā)生發(fā)展的必要過程,在許多神經(jīng)退行性疾病包括AD中,神經(jīng)元軸突營養(yǎng)不良可能會導致軸突退行性變和神經(jīng)元大量丟失,最后表現(xiàn)為認知和記憶障礙[10]。因此促進軸突生成不僅可以阻止AD病人腦中神經(jīng)元軸突退行性變,而且還有可能促進退變軸突的再生。

細胞內(nèi)神經(jīng)元突起或軸突生長需要兩種細胞骨架重組即肌絲[2]和微管[11]。微管的聚集存在于神經(jīng)元的胞體和生長錐[12]。微管在軸突聚集通過2種方式：一種是微管聚合物的運輸;另一種是微管聚集加尾。這兩種方式都可以促進軸突的生長[13]。其中微管相關蛋白,如 Tau、MAP1A、MAP1B等蛋白分子在參與神經(jīng)元軸突微管聚集和組裝過程中起重要作用[14]。但更多與軸突相關的微管相關蛋白在神經(jīng)元軸突生長中的作用尚不清楚。

CRMPs家族在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中高度表達,尤其是腦組織發(fā)育的早期表達較多,該家族包括CRMP 1-5共5個成員,它們作為突起生長的信號分子參與神經(jīng)元的發(fā)育過程。國外研究發(fā)現(xiàn)：CRM P-2與管蛋白異二聚體相互作用而促進微管的聚集[6];CRMP-2通過與Numb以及重組肌絲的相互作用調(diào)節(jié)某些特異的黏附分子如L1的內(nèi)吞[7];CRMP-2可以與驅(qū)動蛋白-1輕鏈作用而將管蛋白異二聚體或Sra-1連接至驅(qū)動蛋白-1(Kinesin-1),然后CRMP-2/Kinesin-1復合物可以將管蛋白等運輸?shù)捷S突遠端[8],但國內(nèi)有關CRMP-2與軸突生長的關系尚無相關研究。我們通過轉(zhuǎn)染外源性DNA上調(diào)或下調(diào)CRM P-2表達水平,檢測了其對神經(jīng)元軸突生長的影響。研究結果表明過表達野生型CRMP-2可明顯促進軸突生長,而磷酸化CRMP-2的突變體則沒有顯示任何的促進作用。以上結果表明非磷酸CRMP-2可促進神經(jīng)元軸突生成和神經(jīng)元極性建立。

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