王亞珍，呂品田，王鳳紅，王辰英，焦俊芳，鄭振茹

赤芍總苷抑制人黑色素瘤A375細胞株增殖作用的研究

王亞珍，呂品田，王鳳紅，王辰英，焦俊芳，鄭振茹

目的 觀察赤芍總苷 (TPG)對人黑色素瘤A375細胞增殖的影響及其作用機制。方法 黑色素瘤A375細胞，分別加入12.5、25、50、100、200 mg/L TPG，對照組加等量0.9%氯化鈉注射液，孵育48 h。采用四甲基偶氮唑藍 (MTT)方法測定細胞生長抑制率，用RT－PCR、Western blot法分別檢測增殖細胞核抗原 (PCNA)、P21、P27、P53 mRNA及其蛋白的表達水平。結(jié)果 不同濃度 (12.5、25、50、100、200 mg/L)TPG刺激后，對黑色素瘤細胞均具有明顯的增殖抑制作用。100 mg/L TPG作用黑色素瘤細胞48 h，PCNA mRNA及其蛋白表達水平較對照組顯著下降，而P21、P27、P53的mRNA及其蛋白表達水平較對照組顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.01)。結(jié)論 TPG抑制黑色素瘤A375細胞增殖，與下調(diào)PCNA表達及上調(diào)P21、P27、P53表達有關(guān)。

赤芍總苷;人黑色素瘤細胞;細胞增殖;增殖細胞核抗原

赤芍是重要的活血化瘀中藥，常以復(fù)方組成成分作用于腫瘤和血瘀癥的治療。赤芍總苷 (total paeonyglucosides，TPG)為中藥赤芍的提取物。目前，僅有少數(shù)研究報道TPG對腫瘤細胞的生長有抑制增殖、促進凋亡的作用［1］，但具體機制尚未闡明。本研究以惡性黑色素瘤細胞作為研究對象，觀察TPG對細胞增殖活性和增殖細胞核抗原 (PCNA)、P21、P27、P53 mRNA及蛋白表達水平的影響，為開發(fā)新的抗腫瘤藥物及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 黑色素瘤A375細胞株購自中國科學(xué)院上海細胞研究所，RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清 (美國 Gibco公司)、MTT(美國Sigma公司)，RT－PCR試劑盒 (大連寶生物工程有限公司)，PCNA、P21、P27、P53一抗 (美國Santa Cruz公司)，引物由上海生工生物技術(shù)公司合成，赤芍總苷由河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院惠贈。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測細胞增殖活性 黑色素瘤A375細胞以含10%胎牛血清的RPMI1640常規(guī)培養(yǎng)，將對數(shù)生長期的細胞接種于96孔板，饑餓24 h使細胞同步于G0期。分別以不同濃度 (12.5、25、50、100、200 mg/L)TPG 刺激 48 h，或以100 mg/ml TPG刺激不同時間 (24、48 h)，對照組加等量0.9%氯化鈉注射液，四甲基偶氮唑藍 (MTT)孵育4 h后棄去上清，再加二甲基亞砜 (DMSO)孵育10 min，酶標儀上測其吸光度值。每組設(shè)6個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。生長抑制率(%)=(1－TPG組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.2 總RNA的提取及RT－PCR 以100 mg/L TPG刺激黑色素瘤細胞48 h，收集細胞，Trizol一步法提取總RNA，按RT－PCR試劑盒說明進行反轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)。PCNA引物序列:上游5'－ GTGAATTTGCACGTATATGCCG－3'，下游5'－GCAATTTTATACTCTACAACAAGGGG －3'，擴增產(chǎn)物長 302 bp。P21引物序列:上游5'－CCCGTGAGCGATGGAACTT－3'，下游5'－ GCGTTTGGAGTGGTAGAAATCT－3'，擴增產(chǎn)物長332 bp。P27引物序列:上游5'－TGCGAGTGTCTAACGGGAG－3'，下游5'－ CCTTCTCCACCTCTTGCCA －3'，擴增產(chǎn)物長234 bp。P53引物序列:上游5'－GCGCCATGGCCATCTACAAG－3'，下游 5'－ GAGTCTTCCAGTGTGATGATGGT－3'，擴增產(chǎn)物長308 bp。內(nèi)參照GAPDH引物序列:上游5'－ACCACAGTCCATGCCATCAC－3'，下游 5'－TCCACCACCCTGTTGCTG－3'，擴增產(chǎn)物長452 bp。PCR反應(yīng)條件為95℃ 4 min，預(yù)變性后，95℃ 30 s，56℃ 40 s，72℃ 30 s，25個循環(huán)后，72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴增產(chǎn)物，凝膠成像分析系統(tǒng)進行密度分析。GAPDH作為內(nèi)參照，比較各目的基因片段密度值/內(nèi)參照密度值的比值。

1.2.3 Western blot法檢測PCNA、P21、P27及P53蛋白的表達 以100 mg/L TPG刺激黑色素瘤細胞48 h，收集細胞，常規(guī)方法裂解細胞提取總蛋白，用改良Lowry法進行蛋白定量。取100 μg蛋白，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗4℃孵育過夜，PBS漂洗三次后，二抗辣根過氧化酶 (HRP)－IgG(1∶1 000)室溫孵育2 h，洗膜，化學(xué)發(fā)光法顯色，對條帶進行灰度掃描。GAPDH作為內(nèi)參照，比較各蛋白吸光度值/內(nèi)參照吸光度值的比值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計檢驗。計量資料以(±s)表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TPG對黑色素瘤A375細胞活力的影響 MTT實驗結(jié)果顯示，TPG可明顯抑制黑色素瘤細胞的增殖活性，在12.5、25、50、100、200 mg/L濃度范圍內(nèi)，隨著藥物濃度的增加，對視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞增殖活性的抑制作用亦明顯增強，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴效應(yīng)。藥物作用24 h及48 h實驗均證實這一結(jié)果，其中100 mg/L濃度作用細胞48 h時抑制作用已較為顯著 (見圖1)。

2.2 TPG對黑色素瘤細胞PCNA、P21、P27及P53 mRNA表達的影響 RT－RCR結(jié)果顯示，100 mg/L TPG作用黑色素瘤細胞48 h后PCNA mRNA表達水平較對照組顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.01)，是對照組的66.2%;而細胞周期抑制因子P21、P27、P53 mRNA水平則較對照組顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.01)，分別是對照組的2.16、2.00、1.97、1.94倍 (見表1、圖2)。

圖1 不同濃度的TPG作用不同時間后對人黑色素瘤A375細胞抑制率的影響Figure 1 Inhibitory effects of TPG on proliferation of human melanoma A375 cells at different time and concentration

表1 TPG對黑色素瘤細胞PCNA、P21、P27、P53 mRNA表達的影響(n=6，±s)Table 1 Expression of PCNA，P21，P27，P53 mRNA after treatment with TPG in human melanoma A375 cells

表1 TPG對黑色素瘤細胞PCNA、P21、P27、P53 mRNA表達的影響(n=6，±s)Table 1 Expression of PCNA，P21，P27，P53 mRNA after treatment with TPG in human melanoma A375 cells

組別PCNA P21 P27 P53對照組0.68±0.08 0.32±0.04 0.34±0.05 0.33±0.04 TPG組 0.45±0.06 0.69±0.07 0.67±0.09 0.64±0.08 t 5.63 －11.24 －7.85 －8.49 P值值＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

圖2 TPG對黑色素瘤細胞PCNA、P21、P27、P53 mRNA表達的影響Figure 2 Expression of PCNA，P21，P27，P53 mRNA after treatment with TPG in human melanoma A375 cells

2.3 TPG對黑色素瘤細胞PCNA、P21、P27及P53蛋白表達的影響 Western blot結(jié)果顯示，100 mg/L TPG處理黑色素瘤細胞48 h后PCNA水平較對照組顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.01)，是對照組的47.0%;而細胞周期抑制蛋白P21、P27、P53水平則較對照組顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，分別是對照組的2.50、2.03、2.31倍 (見表2、圖3)。

表2 TPG對黑色素瘤細胞PCNA、P21、P27、P53蛋白表達的影響(n=6，±s)Table 2 Expression of PCNA，P21，P27，P53 protein after treatment with TPG in human melanoma A375 cells

表2 TPG對黑色素瘤細胞PCNA、P21、P27、P53蛋白表達的影響(n=6，±s)Table 2 Expression of PCNA，P21，P27，P53 protein after treatment with TPG in human melanoma A375 cells

組別PCNA P21 P27 P53對照組0.66±0.09 0.28±0.04 0.33±0.05 0.29±0.04 TPG組 0.31±0.06 0.70±0.09 0.67±0.09 0.67±0.08 t 7.93 －10.45 －8.09 －10.41 P值值＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

圖3 TPG對黑色素瘤細胞PCNA、P21、P27、P53蛋白表達的影響Figure 3 Protein expression of PCNA，P21，P27，P53 of human melanoma A375 cells treated with TPG

3 討論

尋找天然的高效低毒抗癌活性成分或先導(dǎo)化合物一直是研究的熱點［2－6］，新近發(fā)現(xiàn)的TPG即具有高效低毒的特點。研究表明，TPG具有抗腫瘤的作用［7－8］，然而其具體機制尚不明確。本實驗采用MTT法觀察了不同濃度TPG作用不同時間對黑色素瘤細胞增殖的影響，結(jié)果顯示12.5、25、50、100、200 mg/L TPG對黑色素瘤細胞增殖均有抑制作用，且呈劑量依賴關(guān)系，其中以100、200 mg/L TPG作用效果最為明顯。TPG刺激48 h較24 h抑制作用明顯。因此，本研究選擇100 mg/L TPG刺激黑色素瘤A375細胞48 h，進一步觀察其對黑色素瘤細胞增殖抑制的mRNA水平和蛋白水平的影響。

腫瘤的增殖活性決定了它的惡性程度，腫瘤細胞增殖程度越高，腫瘤組織生長越快，越容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，惡性程度越高。PCNA的合成與DNA復(fù)制和細胞增殖直接相關(guān)，是控制DNA復(fù)制以及細胞分裂的關(guān)鍵因素，因此它的表達程度反映了細胞增殖活性的高低，目前已把它作為衡量細胞增殖狀態(tài)的一個客觀指標［9］。此外，本研究還檢測了與細胞周期密切相關(guān)的其他蛋白，其中細胞周期抑制蛋白P21、P27可阻抑細胞周期進程，降低細胞的增殖活性;野生型P53作為抑癌基因，能夠抑制腫瘤細胞增殖，使細胞停滯于G0/G1期，從而誘導(dǎo)細胞凋亡［10］。該基因突變后抑癌作用減弱或消失，則會導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。因此，P53基因在腫瘤的發(fā)生過程中也發(fā)揮著非常重要的作用［11－12］。本實驗證明了100 mg/L TPG對黑色素瘤細胞生長抑制的作用最為明顯，并從分子生物學(xué)角度進一步檢測了細胞內(nèi)周期相關(guān)蛋白PCNA、P21、P27和P53 mRNA及蛋白水平的變化，結(jié)果顯示，與對照組比較，黑色素瘤細胞PCNA mRNA及其蛋白表達均明顯下降，P21、P27、P53 mRNA及其蛋白表達均顯著升高，提示TPG能通過下調(diào)PCNA蛋白的表達及上調(diào)P21、P27、P53蛋白的表達，來改變腫瘤細胞周期進程，發(fā)揮抗腫瘤的作用。

總之，TPG可抑制黑色素瘤細胞增殖，且具有濃度依賴性，這種增殖抑制與下調(diào)PCNA表達、上調(diào)細胞周期抑制蛋白P21、P27以及P53表達有直接關(guān)系。

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Inhibitory Effect of Total Paeonyglucosides on Proliferation of Human Malignant Melanoma A375 Cells

WANG Yazhen，LV Pin －tian，WANG Feng －h(huán)ong，et al.Health Department，Hebei General Hospital，Shijiazhuang 050051，China

ObjectiveTo investigate the effects of total paeonyglucosides(TPG)on proliferation of human malignant melanoma A375 cell，and to further elucidate its molecular mechanisms.MethodsHuman malignant melanoma cells were cultured with TPG(12.5，25，50，100，200 mg/L)and the control group was cultured with 0.9%NaCl injection for 48h.The rates of growth inhibition were tested by MTT assay.RT－PCR and Western blot were used to test PCNA，P21，P27 and P53 mRNA and the expression of protein.ResultsThe proliferation of human malignant melanoma cells was obviously inhibited by TPG of different concentrations(12.5，25，50，100，200 mg/L).After culturing with 100 mg/L TPG for 48 h，the level of PCNA mRNA and the level of its protein expression in malignant melanoma cells were significantly decreased compared with control group，while the level of mRNA in P21，P27 and P53 and the level of their protein expression were significantly increased(P ＜0.01).ConclusionTPG can inhibit human malignant melanoma proliferation by down－regulating the expression of PCNA and up－regulating P21，P27 and P53.

Total paeonyglucosides;Human malignant melanoma cell;Cell proliferation;Proliferating cell nuclear antigen

R 739.5

A

1007－9572(2011)12－4173－03

河北省科技廳科研基金資助項目 (10276105D－65)

050051河北省石家莊市，河北省人民醫(yī)院保健處 (王亞珍，王辰英)，腫瘤科 (呂品田，鄭振茹)，院辦室 (王鳳紅);廣平縣人民醫(yī)院婦產(chǎn)科 (焦俊芳)

呂品田，050051河北省石家莊市，河北省人民醫(yī)院腫瘤科;E－mail:gotoireland2002@yahoo.com.cn

2011－09－10;

2011－11－14)

(本文編輯:劉莉)