王振寶，呂品田，賈漪濤，王志敏，黃萬剛，耿瑞超，李中信

磷脂酰肌醇－3－羥基激酶抑制劑LY294002對肝細胞生長因子促人結腸癌細胞SW620增殖和遷移行為的影響

王振寶，呂品田，賈漪濤，王志敏，黃萬剛，耿瑞超，李中信

目的 探討磷脂酰肌醇－3－羥基激酶 (PI3K)抑制劑LYZ94002在肝細胞生長因子 (HGF)促進結腸癌細胞SW620增殖、侵襲中所起的作用。方法 分別用噻唑藍比色法 (MTT)、流式細胞術及劃痕實驗檢測結腸癌細胞增殖、細胞周期、凋亡及移行情況。結果 (1)MTT法結果顯示，LY294002≥20 μmol/L實驗組與對照組吸光度(OD)值比較，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。(2)流式細胞術結果顯示，LY294002≥20 μmol/L實驗組與對照組凋亡率及增殖指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。(3)劃痕實驗結果顯示，LY294002≥40 μmol/L實驗組與對照組移行距離比較，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。結論 PI3K信號通路抑制劑能夠阻斷HGF對人結腸癌細胞增殖、凋亡、移行的促進作用。

PI3K/AKT;肝細胞生長因子;結腸腫瘤;細胞增殖;細胞凋亡;移行

結直腸癌是我國胃腸道最常見的惡性腫瘤之一，隨著生活環(huán)境和飲食習慣及結構的改變，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。盡管目前采用了包括手術、化療和放療在內(nèi)的綜合治療，但總體效果仍不令人滿意，其總的5年生存率仍徘徊在60%～70%［1］。治療失敗的主要原因在于腫瘤發(fā)生了復發(fā)、轉移。然而，惡性腫瘤復發(fā)轉移的確切機制遠未闡明。

在已知的多個參與腫瘤轉移基因當中，肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)備受關注。HGF是一種多功能的生物學因子，具有強促分裂、組織成形、誘導上皮細胞遷移、侵襲以及誘導血管生成等作用［2］，可由多種細胞分泌。HGF的受體是c－Met癌基因編碼的c－Met蛋白。正常的HGF/c－Met信號轉導在胚胎發(fā)育、組織損傷修復中起重要作用，而異常的HGF/c－Met信號轉導與腫瘤發(fā)生，尤其是侵襲和轉移密切相關［3］。有資料顯示，結直腸癌患者血漿中的HGF水平增高，且分期越晚，HGF的表達水平越高，合并肝轉移的結直腸癌患者較無肝轉移的結直腸癌患者的HGF表達水平更高［2－4］。磷脂酰肌醇 －3 － 羥基激酶/蛋白激酶 B(PI3K/AKT)是HGF下游信號通路中的一條，參與了許多生物功能的調(diào)節(jié)如細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡，調(diào)控細胞周期等，但同時有研究顯示腫瘤的生成與發(fā)展也與PI3K/AKT途徑有關［5］。

我們在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，HGF可以促進人結腸癌細胞SW620的增殖、移行，并使細胞內(nèi)微絲、微管數(shù)量增加［6］。但尚不清楚阻斷PI3K/AKT信號傳導通路是否會抑制HGF的促SW620增殖及侵襲作用。

本實驗在人結腸癌細胞SW620中加入PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002后加入人重組肝細胞生長因子 (rhHGF)，應用噻唑藍比色法 (MTT)、劃痕實驗、流式細胞術，觀察用LY294002阻斷PI3K/AKT信號通路對HGF的促進結腸癌細胞SW620增殖、移行作用的影響，以期闡明PI3K/AKT信號通路對HGF/c－Met促進腫瘤增殖、移行的細胞內(nèi)信號傳導機制。

1 材料與方法

1.1 材料 SW620人結腸癌細胞系由浙江大學鄭樹教授惠贈，rhHGF購自PEPROTECH公司 (美國)，U0126購自 Invitrogen/GIBCO公司 (美國)。

1.2 方法

1.2.1 人結腸癌細胞SW620的培養(yǎng) SW620細胞株用沙氏瓊脂培養(yǎng)基 (RPMI－1640)置于37℃、5%二氧化碳 (CO2)的條件下細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，每2～3 d用胰酶消化，傳代培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法分析LY294002對SW620增殖的影響 將SW620細胞以1.0×104/ml濃度接種于96孔培養(yǎng)板，實驗組分6組，前5組加入終濃度為80、40、20、10、5 μmol/L的LY294002，第6組加終濃度為0.1%體積濃度的二甲基亞砜(DMSO)為DMSO組，對照組加入同體積的培養(yǎng)液。30 min后各組均加入終濃度為20 μg/L的HGF，培養(yǎng)48 h后測定各孔的吸光度 (OD)值。抑制率為: (OD對照組－OD實驗組)/OD對照組×100%。實驗重復3次。

1.2.3 流式細胞術檢測LY294002對SW620細胞周期、凋亡的影響 將SW620細胞以1.0×106/ml濃度接種于培養(yǎng)瓶，實驗組4組分別加入終濃度為 80、40、20、10 μmol/L的LY294002，對照組加入同體積的培養(yǎng)基，30 min后5組分別加入終濃度為20 μg/L HGF，培養(yǎng)48 h后收集細胞、漂洗離心、固定、送流式細胞儀檢測，增殖指數(shù) (PI)=合成期(S)、分裂前期 (G)、分裂期 (M)細胞總數(shù)占不同細胞周期的細胞數(shù)的百分比，即 (S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。

1.2.4 劃痕實驗檢測LY294002對SW620移行的影響 將SW620細胞以2.0×106/孔接種于六孔培養(yǎng)板中，8 h后用10 μl槍頭在6孔培養(yǎng)板上劃痕，實驗組分為3組，前2組加入終濃度為80、40 μmol/L的LY294002，第3組為 DMSO組加入終濃度為0.1%體積濃度的DMSO，對照組加同體積的培養(yǎng)液。30 min后各組加入終濃度為20 μg/L的HGF，24 h后觀察細胞生長情況并更換培養(yǎng)基并加入相應濃度的LY294002、HGF，繼續(xù)培養(yǎng)。每24 h重復上述步驟，直至第3 d。采用Image pro plus軟件測量劃痕空白區(qū)寬度，并計算出其移行距離 L(μm)，公式為:L(μm)=(L 0 h－L n h)/2。移行距離抑制率為:(L對照組－L實驗組)/L對照組×100%。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用(±s)表示，組間比較采用單因素多水平方差分析 (one way ANOVA)，多重比較用SNK－q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LY294002對SW620增殖的影響 應用MTT法結果顯示，不同濃度實驗組、DMSO組、對照組OD值比較，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。其中終濃度為 80、40、20 μmol/L LY294002實驗組與對照組OD值比較，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05);且這3個濃度組間OD值比較，差異亦有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05，見表1)。3個濃度組對SW620增殖的抑制率分別為35.1%、29.9%、14.2%。

2.2 LY294002對凋亡、細胞分裂周期的影響 流式細胞術顯示，不同濃度實驗組與對照組凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。其中終濃度為80、40、20 μmol/L LY294002實驗組與對照組凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05);且這3個濃度組間凋亡率比較，差異亦有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。實驗組與對照組PI比較，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。其中終濃度為80、40、20 μmol/L LY294002實驗組與對照組PI比較，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05);且這3個濃度組間PI比較，差異亦有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05，見表2)。

表1 LY294002不同濃度對SW620細胞增殖的影響Table 1 The effect of LY294002 of different concentrations on the proliferation of SW620 cells

表2 LY294002對SW620細胞凋亡率及PI的影響(±s)Table 2 The effect of LY294002 on the apoptosis ratio and PI of SW620cells

表2 LY294002對SW620細胞凋亡率及PI的影響(±s)Table 2 The effect of LY294002 on the apoptosis ratio and PI of SW620cells

注:與對照組比較，▲P＜0.05;與對照組比較，△P＞0.05;與20 μmol/L組比較，*P ＜0.05;與40 μmol/L組比較，■P ＜0.05

組別 次數(shù) 凋亡率PI實驗組(μmol/L)80 3 1.45±0.06▲＊■ 35.1±2.2▲＊■40 3 1.20±0.08▲＊ 44.8±1.4▲＊20 3 1.04±0.12▲ 48.6±2.2▲10 3 0.74±0.14△ 52.5±1.1△對照組 3 0.61±0.08 55.2±2.8 F 58.92 72.99 P值值＜0.05 ＜0.05

2.3 LY294002對SW620移行的影響 劃痕實驗顯示，藥物作用24 h、48 h、72 h后實驗組、DMSO組與對照組移行距離比較，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。其中24 h后，80 μmol/L LY294002實驗組與對照組移行距離比較，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05);48 h、72 h后80、40 μmol/L LY294002實驗組與對照組移行距離比較，差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05);而24 h、48 h、72 h后DMSO組與對照組移行距離比較，差異均無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05)。80 μmol/L LY294002實驗組24 h、48 h、72 h的移行距離抑制率分別為61.2%、61.7%、54.3%(見表3)。

表3 LY294002不同時間對SW620細胞移行距離及其抑制率的影響Table 3 The effect of LY294002 on the migration ratio of SW620 cells

3 討論

HGF是一種廣泛分布于各組織的細胞外信號因子，不僅存在于多種正常組織細胞內(nèi)，而且一些腫瘤細胞也可以產(chǎn)生。有研究發(fā)現(xiàn)結直腸癌患者的血漿中HGF水平明顯高于正常人［5］。我們的前期實驗表明，HGF可以促進SW620細胞的增殖、移行及上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial cell growth factor A，VEGF－A)、VEGF－C、VEGF－D 的表達［6］。另有研究顯示，PI3K/AKT通路在細胞中普遍表達信號途經(jīng)，不僅參與正常細胞的生理活動，還與腫瘤侵襲、轉移等多種生物行為有關［7］。在未轉化的腸上皮細胞和結腸腫瘤細胞中，PI3K/AKT信號通路已經(jīng)證實能夠轉導來自生長因子受體的促有絲分裂信號［8］。本實驗應用 PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002抑制了HGF促SW620細胞增殖、移行及抗凋亡的作用。

本研究結果顯示，不同濃度的LY294002抑制HGF對SW620細胞增殖的抑制率是不同的，即濃度較高的LY294002抑制HGF對SW620細胞增殖作用大，提示LY294002抑制PI3K/AKT信號通路活性可以抑制HGF促進SW620增殖的生物學活性，而被激活的PI3K是靠進一步激活其下游AKT來發(fā)揮作用的。Nanaw等［9］發(fā)現(xiàn)人類結腸直腸腫瘤組織中磷酸化AKT表達增多，活化的AKT通過促進細胞增殖并抑制其凋亡從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

本研究結果顯示，不同濃度的LY294002對SW620細胞凋亡率是不同的，濃度較高的對SW620細胞的凋亡率較高，LY294002有效地抑制了HGF促進SW620細胞周期進程，起到抗凋亡作用，提示LY294002可能是通過抑制PI3K進而抑制了其下游細胞信號的傳導而導致了SW620細胞增殖減少、凋亡率增加。這與文獻報道的一致［10］。這些研究都為抑制PI3K即能抑制HGF促進SW620細胞周期進程、抗凋亡的生物學活性提供了有力的證據(jù)。

本研究結果顯示，高濃度的LY294002可以抑制20 μg/L HGF對SW620促移行作用。本實驗加入PI3K抑制劑后出現(xiàn)移行距離縮短，證明抑制PI3K信號通路可以抑制HGF對SW620細胞促移行作用。研究顯示，作為PI3K下游信號的AKT可促進細胞內(nèi)肌動蛋白中間絲重構從而提高細胞運動能力［11］。

HGF通過激活c－Met受體使其發(fā)生自體磷酸化，被激活的c－Met受體與細胞內(nèi)的一些靶蛋白直接作用導致包括PI3K/PKB、ERK/MAPK、磷脂酶、生長因子受體結合蛋白及其相關蛋白、轉錄激活子STAT等信號傳遞途徑的級聯(lián)激活。由此可見HGF是靠多條信號通路發(fā)揮其生物學作用的，抑制其中某一條通路是否會出現(xiàn)抑制腫瘤的作用，不僅與該信號通路是否管理著細胞的存活生長機制;在該機制中所起作用的多少;是否會產(chǎn)生負反饋調(diào)節(jié);還與阻斷該信號途經(jīng)其他信號途經(jīng)是否會代償性增強等有關。不同基因在不同種類的細胞中表達量是不同的，即使是同一種腫瘤中，不同個體腫瘤內(nèi)某一關鍵蛋白表達量也是有所差別的，本實驗結果的產(chǎn)生也與HGF及其受體c－Met和PI3K在該細胞中表達的相對水平有關，而且對于抑制該信號途經(jīng)關鍵分子PI3K后其下游信號即AKT的量是否下降也需進一步檢測。

總之，PI3K抑制劑LY294002能夠抑制HGF促進腫瘤細胞SW620的增殖、移行及抗凋亡作用，這為探索新的治療結直腸癌方法提供了實驗依據(jù)。

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The Role of PI3K Inhibitors(LY294002)in the Proliferation，Apoptosis and Migration of SW620 Activated by HGF

WANG Zhen－bao，LV Pin－tian，JIA Yi－tao，et al.The Second Department of Surgery，the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050051，China

ObjectiveTo investigate the role of PI3K inhibitors(LY294002)in the proliferation，apoptosis and migration of SW620 activated by HGF.MethodsThe proliferation of SW620 cells activated by HGF was assessed by MTT，while the apoptosis was examined by Flow Cytometry(FCM)and the migration was detected by Scratch test.Results(1)MTT test showed that LY294002≥20 μmol/L，and the difference of OD value between experiment group and control group was statistically significant(P ＜0.05).(2)Flow cytometry showed that LY294002≥20 μmol/L.The differences of apoptosis rate and proliferation index between experiment group and control group were statistically significant(P＜0.05).(3)Scratch test showed that LY294002≥40 μmol/L.The difference of migration of SW620 between experiment group and control group was statistically significant(P＜0.05).ConclusionPI3K/AKT signaling pathway can inhibit the activation of proliferation，apoptosis and migration of SW620 by HGF.

PI3K/AKT;Hepatocyte growth factor;Colonic neoptasms;Cell proliferation;Apoptosis;Migration

R 735.3

A

1007－9572(2011)12－4170－03

國家自然科學基金 (81172332)

050051河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院外二科 (王振寶，黃萬剛，耿瑞超，李中信);河北省人民醫(yī)院腫瘤二科(呂品田);河北省人民醫(yī)院腫瘤三科 (賈漪濤);河北省邢臺市腫瘤醫(yī)院腹瘤科 (王志敏)

李中信，050051河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院外二科;E－mail:lizhongxin99@yahoo.com.cn

2011－09－15;

2011－11－15)

(本文編輯:丁云)