李延紅，周占業(yè)，史 齊，皇甫超申

(河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，河南開封 475004)

人體亞硝酸鹽不僅是一氧化氮(nitric oxide，NO)代謝過程中的一種惰性產(chǎn)物［1］，而且在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)以及維持內(nèi)環(huán)境NO穩(wěn)態(tài)中起重要的作用［2］。通常情況下，組織氧含量正常，體內(nèi)NO由一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，NOS)產(chǎn)生;但是在組織缺氧時(shí)，體內(nèi)NO則來自于亞硝酸鹽還原途徑［3］。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)低濃度的亞硝酸鹽及其還原產(chǎn)生的NO共同通過抑制細(xì)胞線粒體活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生、減少氧的消費(fèi)、激活NO/cGMP通路等一系列事件發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)、血管再生、舒張血管的功能，從而拮抗缺血/再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)誘導(dǎo)的組織損傷［4］。低劑量亞硝酸鈉不僅對(duì)細(xì)胞無明顯毒害，而且對(duì)細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用［5］。乙醇對(duì)腦組織的損傷主要是通過ROS實(shí)現(xiàn)的，從理論上分析，用低濃度的亞硝酸鹽預(yù)處理，神經(jīng)元可以拮抗乙醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。為此，本實(shí)驗(yàn)選用大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(rat pheochromoeytoma cells，PC12)［6］探討亞硝酸鹽對(duì)乙醇誘導(dǎo)的細(xì)胞過氧化損傷的拮抗作用，為科學(xué)評(píng)價(jià)亞硝酸鹽藥理作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器

1.1.1主要試劑PC12細(xì)胞系購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。亞硝酸鈉(NaNO2)，天津市晨?；瘜W(xué)試劑廠(分析純);DMEM培養(yǎng)基(Gibco，with high glucose);胎牛血清，杭州四季青生物公司產(chǎn)品;一氧化氮清除劑c-PTIO(2-(4-carboxyphenyl)-4，4，5，5-tetramathylimidazoline-1-oxyl-3-oxide)、二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(lán)(MTT)、Hoecheste 33258 和PI購自Sigma公司。FITC-AnnexinⅤ/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于美國Bender公司;可見光法測丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)含量，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)活力測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。兔抗Caspase-3、Caspase-9多克隆抗體，Bcl-2、Bax單克隆抗體(Santa Cruz生物技術(shù)公司)。β-actin抗體、兔抗 HIF-1α抗體、enhanced chemiluminescence(ECL)顯色試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(HRP-polymer goat anti-rabbit IgG)(碧云天公司)。

1.1.2主要儀器Multiskan MK3型酶標(biāo)儀(賽默飛世爾儀器有限公司)。FACS Salibur流式細(xì)胞儀(BD，美國);BX51熒光顯微鏡(OLYMPUS，日本);UV-540紫外-可見分光光度計(jì)(UNICAM，美國)。DYY-7C型電泳儀(北京市六一儀器廠)。WD-9413B凝膠成像分析儀(北京市六一儀器廠)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為10%的滅活胎牛血清、青霉素(1×105IU·L－1)和鏈霉素(100 mg·L－1)的DMEM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)溫度為37℃，含5% 二氧化碳(CO2)的細(xì)胞培養(yǎng)箱，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以0.25% 胰蛋白酶消化傳代，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×107·L－1，備用。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組及處理預(yù)處理PC12細(xì)胞的亞硝酸鈉濃度選用課題組前期MTT結(jié)果，即亞硝酸鈉最低促PC12細(xì)胞增殖效應(yīng)(高于對(duì)照組15%)濃度為 0.14 mmol·L－1，預(yù)處理時(shí)間為 24 h［7］。實(shí)驗(yàn)分4組:對(duì)照組加等量培養(yǎng)液;單純乙醇處理組加400 mmol·L－1(IC50值)乙醇作用 2 h;預(yù)處理組先用0.14 mmol·L－1亞硝酸鈉預(yù)處理 24 h，再加 400 mmol·L－1乙醇作用 2 h;NO 清除組用0.14 mmol·L－1亞硝酸鈉和 40 μmol·L－1c-PTIO 共同預(yù)處理24 h，再加 400 mmol·L－1乙醇作用 2 h。

1.2.3MTT法檢測細(xì)胞增殖活力取1×107·L－1PC12細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(每孔0.2 ml)培養(yǎng)24 h后換液，按照實(shí)驗(yàn)分組經(jīng)不同處理后，每孔加入20 μl MTT，4 h后，吸去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO于振蕩器上振搖，待藍(lán)色晶體完全溶解后，在酶標(biāo)儀上測定570 nm處的吸光度值(A值)并計(jì)算細(xì)胞活力。以含有等體積的培養(yǎng)液和DMSO的無細(xì)胞孔測得的A為空白對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。細(xì)胞活力/%=(處理組A值/對(duì)照組A值)×100%。

1.2.4Hoechst 33258/PI活細(xì)胞聯(lián)染判定細(xì)胞生存狀態(tài)將對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞以1×107·L－1濃度接種于預(yù)置蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，按實(shí)驗(yàn)分組處理后，傾去培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS洗3次，特異結(jié)合DNA的熒光染料Hoechst 33258和PI進(jìn)行活細(xì)胞聯(lián)染。加Hoechst 33258 10 mg·L－1及 PI 10 mg·L－1，37℃染色15 min后，紫外光激發(fā)，熒光顯微鏡觀察，電荷耦合器拍片?；罴?xì)胞呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞呈亮白色，壞死細(xì)胞呈紅色。熒光顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，每張爬片計(jì)數(shù)細(xì)胞不少于1 000個(gè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以凋亡細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)比值的百分?jǐn)?shù)表示細(xì)胞凋亡率。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡采用FITC-AnnexinⅤ/PI雙染法，分別收集各組細(xì)胞到10 ml的離心管中，每樣本細(xì)胞數(shù)為1×109·L－1，1 000×g離心5 min，棄去培養(yǎng)液，用孵育緩沖液洗滌1次，1 000×g離心5 min，用100 μl的標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育15 min，1 000×g離心5 min，沉淀細(xì)胞用孵育緩沖液洗1次，加入FITC-AnnexinⅤ/PI溶液5 μl 4℃下孵育20 min，最后補(bǔ)PBS 400 μl，以流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，每個(gè)樣品檢測1萬個(gè)細(xì)胞，用Cellquest軟件進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。

1.2.6脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物與抗過氧化酶活力或含量的測定對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞以1×107·L－1濃度接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，按實(shí)驗(yàn)分組處理后，收集細(xì)胞，按照試劑盒說明書，采用比色法測定細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT活力和GST-Px、MDA含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.2.7Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)細(xì)胞于對(duì)數(shù)生長期進(jìn)行分組處理，作用24 h后用RIPA 200 μl充分裂解提取蛋白，考馬斯亮藍(lán)G-250法測樣品蛋白濃度，均衡每組蛋白濃度后，以12%SDS-PAGE凝膠電泳分離。電轉(zhuǎn)移蛋白至NC膜，5%脫脂奶粉封閉過夜，加入各種一抗(1∶200)于4℃封閉袋中孵育過夜，二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體，1∶4 000)孵育1 h?；瘜W(xué)發(fā)光法顯示結(jié)果，壓片曝光。凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照，檢測蛋白質(zhì)印跡條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)均采用±s表示，應(yīng)用SPSS 13.0軟件包處理，進(jìn)行直線相關(guān)分析，t檢驗(yàn)，單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1亞硝酸鈉預(yù)處理對(duì)PC12細(xì)胞增殖活力的影響由Fig 1可見:單純乙醇處理組細(xì)胞增殖活力與對(duì)照組相比明顯下降(P＜0.05);預(yù)處理組細(xì)胞增殖活力與單純乙醇作用組相比明顯增加(P＜0.05);NO清除組細(xì)胞增殖活力與預(yù)處理組相比有所下降(P＜0.05)。

Fig 1 Cell viability in PC12 cells pretreated 0.14 mmol· L-1 NaNO2for 24 h，then exposed to ethanol for additional 2 h(±s，n=3)

2.2亞硝酸鈉預(yù)處理對(duì)乙醇損傷PC12細(xì)胞生存狀態(tài)的影響Fig 2所示，正?；罴?xì)胞核呈藍(lán)色，染色均一;壞死的細(xì)胞核腫大，呈紅色;凋亡的細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)凝集，呈亮白色。對(duì)照組(Fig 2A)細(xì)胞生存狀態(tài)良好，有少數(shù)細(xì)胞死亡，死亡率約(1.58±0.33)%;單純乙醇處理組(Fig 2B)有大量細(xì)胞壞死和凋亡，兩者占死亡細(xì)胞的比例基本相同，計(jì)數(shù)細(xì)胞死亡率為 (52.4±6.84)%，明顯高于空白對(duì)照組(P＜0.05);預(yù)處理組(Fig 2C)壞死細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞死亡的主要形式是細(xì)胞凋亡 ，計(jì)數(shù)死亡率為(28.1±3.74)% ，與單純用乙醇處理組相比 ，死亡率明顯減少(P＜0.05)。NO清除組(Fig 2D)細(xì)胞凋亡率為(37.98±4.19)%，與預(yù)處理組相比凋亡和壞死細(xì)胞有所增加(P＜0.05，F(xiàn)ig 2E)。

Fig 2 0.14 mmol·L-1NaNO2preconditioning inhibited PC12 cells death induced by high dose ethanol(±s，n=3)

2.3亞硝酸鈉預(yù)處理對(duì)乙醇損傷PC12細(xì)胞凋亡的拮抗作用流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果如Fig 3，NaNO2預(yù)處理對(duì)乙醇損傷的PC12細(xì)胞凋亡拮抗的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見Fig 3E。對(duì)照組(Fig 3A)有少量細(xì)胞凋亡;單純乙醇處理組(Fig 3B)有大批細(xì)胞凋亡，與對(duì)照組相比差異有顯著性(P＜0.05);預(yù)處理組(Fig 3C)細(xì)胞凋亡率與單純用乙醇處理組相比明顯減少(P＜0.05);NO清除組(Fig 3D)細(xì)胞凋亡率與預(yù)處理組相比有所增加(P＜0.05)。

Fig 3 Inhibition of ethanol-treated apoptosis of PC12 cell by NaNO2preconditioning(±s，n=3)

2.4亞硝酸鈉預(yù)處理對(duì)乙醇損傷PC12細(xì)胞MDA含量和抗氧化酶活性的影響Tab 1所示，單純乙醇處理組與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi) CAT、SOD活性GSH-Px含量明顯降低，MDA含量升高(P＜0.05);預(yù)處理組與單純乙醇處理組相比，細(xì)胞內(nèi)CAT、SOD活性和GSH-Px含量明顯升高(P＜0.05)，而MDA含量明顯下降(P＜0.05)。NO清除組與預(yù)處理組相比，細(xì)胞內(nèi)CAT、SOD活性和GSH-Px含量明顯降低，MDA含量升高(P＜0.05)。

Tab 1 Effect of NaNO2preconditioning on the contents of antioxidant enzyme and MDA in ethanol injury PC12 cells(±s，n=3)

Tab 1 Effect of NaNO2preconditioning on the contents of antioxidant enzyme and MDA in ethanol injury PC12 cells(±s，n=3)

*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs Ethanol group;△P＜0.05 vs NaNO2+Ethanol group

Group CAT/103U·g－1Pro T-SOD/103U·g－1Pro GSH-Px/mmol·g－1Pro MDA/mmol·g－1Pro Control 29.33 ±2.3 68.92 ±3.26 78.2 ±3.19 36.26 ±15.6 Ethanol 11.45 ±0.93* 20.95 ±1.68* 41.17 ±2.72* 98.38 ±11.5*NaNO2+Ethanol 19.29 ±0.27# 62.38 ±2.98# 62.59 ±1.41# 49.38 ±2.93#c-PTIO+NaNO2+Ethanol 15.98 ±1.9△ 40.23 ±1.57△ 51.21 ±1.52△ 73.58 ±14.7△

2.5亞硝酸鈉預(yù)處理對(duì)乙醇誘導(dǎo)PC12細(xì)胞線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響Fig 4顯示:單純乙醇處理組與對(duì)照組相比，細(xì)胞促凋亡蛋白Bax、Caspase-9、Caspase-3 表達(dá)增加，而凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)減少(P＜0.05);預(yù)處理組與單純乙醇處理組相比，Bax、Caspase-9、Caspase-3表達(dá)量下降，而Bcl-2表達(dá)量增加(P＜0.05);NO清除組與預(yù)處理組相比，Bax、Caspase-9、Caspase-3表達(dá)量有所增加，而Bcl-2表達(dá)量有所減少(P＜0.05)。

Fig 4 The Caspase-9/Caspase-3 signal pathway involved in PC12 cells apoptosis induced by NaNO2preconditioning and then exposed to 400 mmol·L-1ethanol(±s，n=3)

2.6NaNO2預(yù)處理對(duì)乙醇損傷PC12細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)的影響Fig 5顯示:乙醇處理組細(xì)胞HIF-1α表達(dá)量與對(duì)照組相比有所增加(P＜0.05);預(yù)處理組HIF-1α表達(dá)量較乙醇組相比明顯增加(P＜0.05);NO清除組HIF-1α表達(dá)量較預(yù)處理組有所下降(P＜0.05)。

Fig 5 Expression of HIF-1α in PC12 cells induced by NaNO2preconditioning for 24 h then exposed to ethanol for 2 h(±s，n=3)

3 討論

本課題MTT結(jié)果顯示，先用0.14 mmol·L－1NaNO2預(yù)處理組，較單純乙醇處理的PC12細(xì)胞的活力明顯增加。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，NaNO2預(yù)處理明顯拮抗乙醇誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。熒光染色細(xì)胞核形態(tài)觀察也佐證了上述現(xiàn)象。當(dāng)培養(yǎng)體系內(nèi)NO被清除后，上述低劑量NaNO2預(yù)處理對(duì)乙醇損傷PC12細(xì)胞的保護(hù)作用一定程度上被抑制。結(jié)果提示，亞硝酸鹽及其還原的NO共同參與了乙醇損傷PC12細(xì)胞的保護(hù)作用。

NaNO2預(yù)處理對(duì)乙醇損傷PC12細(xì)胞保護(hù)作用可能與下列因素有關(guān):①ROS產(chǎn)生減少:線粒體是ROS產(chǎn)生的主要場所，也是乙醇作用的靶點(diǎn)。乙醇經(jīng)線粒體細(xì)胞色素P450代謝時(shí)，伴隨產(chǎn)生大量的氧自由基(O－2、H2O2等)，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，通過線粒體途徑啟動(dòng)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞損傷［8］。亞硝酸鹽或NO作用的靶點(diǎn)是線粒體呼吸鏈復(fù)合物I和IV，通過對(duì)靶點(diǎn)的抑制，減少乙醇處理時(shí)細(xì)胞ROS的產(chǎn)生［9］。②ROS清除增加:亞硝酸鹽或其來源的NO提高了細(xì)胞抗氧化酶活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NaNO2預(yù)處理的細(xì)胞，當(dāng)遇到乙醇處理時(shí)，細(xì)胞內(nèi)CAT、SOD活性和GSH-Px含量明顯升高，這樣由乙醇處理細(xì)胞產(chǎn)生的ROS就會(huì)較多的被清除，從而減輕了乙醇對(duì)細(xì)胞的損傷。③抑制線粒體凋亡途徑:亞硝酸鹽還原為NO，NO與細(xì)胞色素C氧化酶相互作用，使細(xì)胞色素C釋放減少，這樣乙醇誘導(dǎo)的線粒體凋亡途徑一定程度上被抑制，拮抗細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用［10］。本課題通過對(duì)線粒體通路相關(guān)分子研究發(fā)現(xiàn)，NaNO2預(yù)處理，明顯逆轉(zhuǎn)乙醇導(dǎo)致的Bax、Caspase-9、Caspase-3升高和Bcl-2降低，NO特異性抑制劑c-PTIO可部分抑制這一現(xiàn)象。結(jié)果提示，亞硝酸鹽及其還原的NO參與了乙醇誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體凋亡拮抗作用［11］。

缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)是細(xì)胞適應(yīng)缺氧而產(chǎn)生的一種核轉(zhuǎn)錄因子，通過上調(diào)糖轉(zhuǎn)運(yùn)和糖酵解酶的相關(guān)基因，使細(xì)胞在低氧或氧化應(yīng)激時(shí)存活下來［12］，除缺氧外，其他如生長因子、激素、NO 等因子皆可導(dǎo)致HIF-1在細(xì)胞內(nèi)積累［13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低劑量NaNO2具有促進(jìn)細(xì)胞HIF-1α累積的作用，這樣亞硝酸鹽預(yù)處理的細(xì)胞就有可能通過HIF-1途徑發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用［14］。

綜上所述，亞硝酸鈉通過提高PC12細(xì)胞抗氧化酶活性、促進(jìn)HIF-1積累，進(jìn)而使細(xì)胞獲得了拮抗乙醇誘導(dǎo)的線粒體途徑凋亡的能力。

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