梅 清，喻 婷，朱玉林，程 君，2，3，葉 英，2，3，李家斌，2，3

(1安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院感染科，2安徽省細菌耐藥監(jiān)測中心，3安徽醫(yī)科大學細菌耐藥研究所，安徽合肥 230022)

萬古霉素是治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA)感染的首選藥物，但隨著萬古霉素的廣泛應用，其最小抑菌濃度(MIC)逐年上升，形成“MIC漂移”現(xiàn)象［1］。萬古霉素中介(VISA)、異質性萬古霉素中介(hVISA)以及萬古霉素耐藥(VRSA)的金黃色葡萄球菌也在美國、日本等多個國家被陸續(xù)報道［2］。目前預防MRSA菌株進一步突變，保護萬古霉素抗感染活性已成為臨床醫(yī)務工作者的當務之急。

耐藥突變選擇窗(mutant selection window，MSW)理論是近年來提出的一個遏制抗菌藥物耐藥的新策略［3］?？咕幬餄舛任挥谝吧舾兄闙IC和防耐藥突變濃度(mutant prevention concentration，MPC)之間時，耐藥突變體就會被選擇性富集擴增。當藥物濃度高于MPC時，這種富集則被抑制。但是由于藥物安全性問題，臨床上單獨應用一種抗菌藥物，要獲得血漿或組織中藥物濃度長時間位于MPC以上是很困難的。本研究通過測定萬古霉素單用及分別與利福平、磷霉素聯(lián)合使用對10株MRSA臨床分離株的防耐藥突變濃度的變化，在體外初步探討兩種不同作用機制的抗菌藥物聯(lián)合應用防止耐藥突變體的產(chǎn)生的影響，以指導臨床合理用藥。

1 材料與方法

1.1菌株來源與鑒定安徽省細菌耐藥監(jiān)測中心2009～2010年收集的臨床標本。從中選取10株對萬古霉素、利福平敏感，同時對磷霉素的MIC≤16.0 mg·L－1的MRSA臨床分離株。MRSA的鑒定參照文獻［4］的方法，所有菌株均擴增出甲氧西林耐藥基因(mecA)和具有金黃色葡萄球菌種特異性的耐熱核酸酶基因(nuc)。

1.2培養(yǎng)基與儀器M-H培養(yǎng)基購自英國Oxiod公司。恒溫振蕩培養(yǎng)箱(國勝儀器廠，江蘇);細菌比濁儀(Oxiod，英國);32R低溫離心機(Hettich，德國);多點接種儀(AQS Manufacturing公司，英國)。

1.3抗菌藥物及試劑萬古霉素 (VAN，批號:130360-200301純度:100%)和磷霉素 (FOS，批號:130350-200001純度:99%)均購自中國藥品生物制品檢定所。利福平(RFP，批號:13292-46-1，250 mg/瓶，純度:97%)和6-磷酸葡萄糖(500 mg/瓶，純度:98% ～100%)均購自Sigma公司 。

1.4最低抑菌濃度(MIC)測定采用瓊脂平板倍比稀釋法，結果按美國臨床實驗室標準化委員會CLSI2010年標準［5］判讀。磷霉素采用瓊脂稀釋法進行MIC，測定時按照CLSI要求每個瓊脂平板加入終濃度為25 mg·L－1的6-磷酸葡萄糖。

1.5防耐藥突變濃度(MPC)的測定［6］

1.5.1含單藥瓊脂平板的配制采用瓊脂平板倍比稀釋法測定抗菌藥物對10株MRSA分離株的MPC。以各單藥MIC為基準，倍比稀釋7個濃度配置瓊脂平板。藥物終濃度分別為各菌株的1×MIC、2×MIC……64×MIC。每個濃度配制4個平板。在測定磷霉素的MPC時，每個瓊脂平板均加入終濃度為25 mg·L－1的6-磷酸葡萄糖。

Tab 1 MICs of 3 antimicrobial agents against 10 strains of MRSA(mg·L－1)

1.5.2含兩藥瓊脂平板的配制以VAN的MIC、MPC為基準，采用倍比稀釋法配制含兩藥的瓊脂平板，具體方法:分別精密量取1 ml不同MIC倍數(shù)濃度的VAN+1 ml濃度為4.0 mg·L－1的RFP 或1 ml濃度為48.0 mg·L－1的FOS(均為常規(guī)用藥后平均血漿藥物濃度［7］)+18 ml M-H瓊脂，在90 mm平皿中混勻，配制成一系列不同濃度的含兩藥瓊脂平板，每個濃度配制4個平板。

1.5.3MPC以及耐藥頻率的測定從新鮮過夜培養(yǎng)的細菌平板上挑取單個菌落接種于20 ml MH肉湯中37℃震蕩過夜培養(yǎng)，3 000 r·min－1離心后棄上清液，細菌再懸浮于200 ml的新鮮MH肉湯中，震蕩培養(yǎng)6 h，離心后將菌液濃度調整為3×1010CFU·ml－1。取 100 μl菌液放在 90 mm 直徑含不同濃度藥物的MH瓊脂平板上，用L形棒涂布均勻，每個濃度4個平板，使每個藥物濃度的細菌總接種量為1.2×1010CFU。35℃培養(yǎng)72 h，以無細菌生長的最低藥物濃度為MPC。每次試驗均對接種菌液稀釋后進行平板菌落計數(shù)，以確定接種細菌量在1010以上。對接近MPC藥物濃度篩選出來菌株接種于不含藥物的瓊脂平板上，傳代2次后再接種于原篩選藥物濃度的平板上，以確定其為耐藥突變體。耐藥頻率的計算按照文獻［8］:將不同藥物濃度平板上的菌落數(shù)除以接種的菌落數(shù)。以上實驗重復3次，取其平均值。

1.6統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)分析采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件對各組數(shù)據(jù)進行非參數(shù)檢驗。

2 結果

2.1抗菌藥物對MRSA的MIC值VAN、RFP和FOS對10株MRSA的MIC值見Tab 1。

2.2抗菌藥物單用及聯(lián)合使用對MRSA的MPC和SI值VAN單用及分別與RFP和FOS聯(lián)合使用，對10株MRSA的MPC和選擇指數(shù)(SI=MPC/MIC)見Tab 2。RFP和FOS單用對10株MRSA的MPC分別為 ＞1 024 mg·L－1和128 ～1 024 mg·L－1。

Tab 2 MPC(mg·L-1)and SI for vancomycin alone and in combination with rifampicin and fosfomycin respectively against 10 strains of MRSA

2.3耐藥頻率VAN單用以及分別RFP及FOS聯(lián)合使用對10株MRSA的耐藥頻率見Tab 3。

Tab 3 Drug-resistant frequencies of vancomycin alone and in combination with rifampicin and fosfomycin respectively against 10 strains of MRSA

3 討論

MRSA是引起醫(yī)院感染的重要致病菌，具有多重耐藥性，治療困難，病死率高，是目前臨床治療的難題［9］。萬古霉素一直被認為是MRSA感染的標準治療，但有報道稱其對MRSA引起的下呼吸道院內(nèi)感染治療失敗率高達40%以上［10］。MSW理論［3］認為:抗菌藥物治療失敗和耐藥菌株的產(chǎn)生可能與臨床藥物劑量落在耐藥突變選擇窗內(nèi)有關，即只殺滅敏感細菌，而菌群中少數(shù)自發(fā)耐藥突變體則被選擇性富集。當藥物濃度高于MPC時，病原菌必須同時發(fā)生兩次或更多次耐藥突變才能生長，這樣耐藥突變體出現(xiàn)的可能性將極小。因此MPC可作為一項指標來評價抗菌藥物的抗菌活性、反映藥物抑制耐藥突變選擇的能力。胡暉等［11］測定了122株MRSA臨床分離株對萬古霉素的MPC，結果顯示其MPC90值為22.4 mg·L－1。這與本研究中10株MRSA對萬古霉素的MPC為16～64 mg·L－1的結果接近。結合藥代動力學參數(shù)看，萬古霉素常規(guī)劑量使用后血漿峰濃度Cmax為 25～40 mg·L－1，略高于MPC值，但是由于萬古霉素組織穿透性弱，在肺、骨等組織中分布的藥物濃度遠低于血漿濃度［12］，往往使感染部位的藥物濃度恰好落在MSW之內(nèi)，若要增大給藥劑量，卻可能產(chǎn)生嚴重的毒副作用，所以在這種情況下萬古霉素單獨使用限制耐藥突變體富集的能力并不理想。

MSW理論提供了一種限制耐藥突變體產(chǎn)生的方法［3］:選擇不同作用機制的抗菌藥物聯(lián)合應用從而關閉或縮小MSW，達到防止細菌耐藥產(chǎn)生同時不增加不良反應的目的。李朝霞等［6］報道在瓊脂平板實驗中，萬古霉素與左氧氟沙星聯(lián)合使用可以使左氧氟沙星單藥對金黃色葡萄球菌ATCC29213的MSW縮小2～4倍，使萬古霉素單藥對金黃色葡萄球菌ATCC29213的MSW縮小4～8倍。Firso等［13］運用體外藥效學模型，成功地證明了莫西沙星+多西環(huán)素在防止金黃色葡萄球菌發(fā)生耐藥方面具有協(xié)同作用。近幾年耐甲氧西林葡萄球菌的耐藥性監(jiān)測顯示萬古霉素、利福平以及磷霉素對MRSA仍保持較高的敏感率［14］。本研究將萬古霉素與利福平、磷霉素聯(lián)合使用，SI較其單用分別下降2～16倍和4～32倍，再次證實了不同作用機制的抗菌藥物聯(lián)合使用可以降低MPC，縮小MSW，減少耐藥菌的生成。這是因為細菌通過單步變異產(chǎn)生耐藥菌的概率為10－7，如果聯(lián)合用藥，細菌必須通過一步變異同時獲得對兩種藥物的耐藥，理論上其發(fā)生率僅為10－14，而人體感染部位的細菌數(shù)量可達到1010CFU卻遠低于1014CFU，因此很難發(fā)生自發(fā)耐藥變異。

本試驗發(fā)現(xiàn)萬古霉素與磷霉素聯(lián)合縮小MRSA耐藥突變窗的能力強于萬古霉素與利福平的聯(lián)合方案(P＜0.01)。這可能與磷霉素和利福平各自限制耐藥突變體富集的能力有關。雖然利福平對10株MRSA的 MIC≤0.016 mg·L－1，MPC 卻高到無法測出(＞1 024 mg·L－1)，而磷霉素的MPC則為128～1 024 mg·L－1，其MSW較利福平窄的多。因此，各單藥的MSW越窄，聯(lián)合使用后MPC降低的幅度越大。這一特征與聶大平等［15］對銅綠假單胞菌防耐藥突變濃度的研究得出的結論一致。

從耐藥頻率看，萬古霉素分別與利福平、磷霉素聯(lián)用，較單用時耐藥頻率均有明顯下降(P＜0.01)。也就是說，雖然聯(lián)合用藥時低濃度萬古霉素(如1×MIC、2×MIC)瓊脂平板上仍然有耐藥突變體的產(chǎn)生，但其數(shù)量大幅降低，這從另一角度也反映出聯(lián)合用藥較單獨用藥更能防止耐藥突變體的富集。

萬古霉素分別與其他抗菌藥物聯(lián)合治療MRSA感染的方案早有報道，但以往的研究大部分基于傳統(tǒng)的MIC治療策略［16］。本研究依據(jù)遏制抗菌藥物耐藥的新理論，對萬古霉素分別聯(lián)合利福平和磷霉素在防耐藥突變濃度方面進行了初步的探討，結果表明這兩種聯(lián)合方案能夠有效的防止耐藥突變體的富集，為臨床合理利用現(xiàn)有抗菌藥物治療MRSA感染，防止耐藥菌的產(chǎn)生提供了理論依據(jù)。由于體內(nèi)藥物濃度處于動態(tài)變化中，受到的影響因素也較多，因此聯(lián)合用藥時藥代動力學相關參數(shù)與耐藥突變體富集的關系還需要在體內(nèi)試驗中得到進一步的研究。

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