李正紅，于 影，楊 銳，方迎艷，楊麗娟，高 琴

(蚌埠醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，安徽蚌埠 233030)

內(nèi)嗎啡肽(endomorphins，EMs)是新發(fā)現(xiàn)的一種阿片樣四肽。EMs有兩種:內(nèi)嗎啡肽-1(EM-1)和內(nèi)嗎啡肽-2(EM-2)。它們有特異性的結(jié)構(gòu)，對(duì)Mu阿片受體有很高的親和力，被認(rèn)為是Mu阿片受體的內(nèi)源性配體［1］。EM-1和EM-2不僅參與鎮(zhèn)痛、心血管、胃腸、內(nèi)分泌等功能的調(diào)節(jié)，也參與對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)［2］。EM-1和EM-2在巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞中被檢測到［3］，它們可改變腹腔巨噬細(xì)胞的功能［4－6］，包括抑制巨噬細(xì)胞的趨化性和超氧負(fù)離子的產(chǎn)生等。

樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)大的專職抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cells，APC)，也是唯一能激活初始性T細(xì)胞的APC。DC的功能特點(diǎn)與其成熟狀態(tài)密切相關(guān)，未成熟DC表達(dá)低水平的協(xié)同刺激分子和黏附分子，誘導(dǎo)T細(xì)胞的能力較弱，但是具有極強(qiáng)的吞噬和加工處理抗原能力。成熟DC細(xì)胞表面MHC-Ⅱ分子和協(xié)同刺激分子表達(dá)增加，其呈遞抗原的能力增強(qiáng)，可與T細(xì)胞相互作用啟動(dòng)免疫應(yīng)答。

既然DC是功能最強(qiáng)大的APC，并且有文獻(xiàn)報(bào)道在人、鼠 DC可表達(dá) Mu阿片受體［7］，但 EMs對(duì)DC免疫功能的調(diào)節(jié)尚未見報(bào)道。本研究觀察EMs對(duì)LPS活化DC過程中細(xì)胞表型、趨化性和T淋巴細(xì)胞增殖能力改變的影響，以期進(jìn)一步揭示內(nèi)嗎啡肽的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品與試劑鼠源集落刺激因子(Pepro-Tech，Rocky Hill，NJ);CD11+磁珠(Miltenyi Biotech，Bergish-Gladbach，Germany);PE標(biāo)記的DC特定的表面分子，如MHC classⅡ、CD11c、CD80、CD86購自 BD-Pharmingen。LPS(lipopolysacchairde，脂多糖)購自 Sigma Aldrich。CTOP(25 μmol·L－1，Mu阿片受體特異性拮抗劑，Sigma，MI)。T細(xì)胞尼龍毛柱購自伊普瑞斯科技有限公司。［3H］胸腺嘧啶核苷購自北京原子能研究所。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6J♀鼠，體質(zhì)量18～22 g，購自北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。

1.2方法

1.2.1骨髓來源的DC的制備與培養(yǎng)用 Inaba等［8］的方法來培養(yǎng)大量的DC，略作改動(dòng)。將7～8周齡的正常C57BL/6J鼠頸椎脫位處死，無菌條件下取完整的股骨、脛骨，剔凈周圍組織，離斷干骺端后，用皮試針抽吸RPMI 1640培養(yǎng)液沖洗髓腔，獲得單細(xì)胞懸液;1 500 r·min－1離心10 min，棄上清后加入適量Tris-NH4Cl破解紅細(xì)胞，再用PBS洗滌兩次后用含10 μg·L－1GM-CSF、10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，種于6孔板，接種密度為1 ×109·L－1～2 ×109·L－1、3 ～4 ml·well－1。d 3，輕輕吸棄未貼壁細(xì)胞、全量換液。d 5，吸棄半量培養(yǎng)基，并補(bǔ)充該量。d 6、d 7，收集懸浮和半貼壁細(xì)胞。

采用CD11c免疫磁珠進(jìn)行磁性分選純化DC。用20 mmol·L－1PBS洗滌細(xì)胞兩次，加入CD11c免疫磁珠，4℃反應(yīng)20 min，離心洗滌后將細(xì)胞懸液加入MS磁分離柱中進(jìn)行分離純化，獲取CD11c+的骨髓來源的樹突狀細(xì)胞，所有操作根據(jù)autoMACS系統(tǒng)的廠商說明書進(jìn)行。采用PE標(biāo)記的倉鼠抗小鼠CD11c mAb，通過流式細(xì)胞儀(florescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)分析純化前后的DC純度。

1.2.2DC表面分子的檢測流式細(xì)胞儀用于DC細(xì)胞表型分析。LPS激活的DC加入不同濃度的EM-1/EM-2，活化的DC不加入EMs用作對(duì)照。經(jīng)過48h的培養(yǎng)，分析DC的表型，DC分別與下列抗體在 4℃ 孵育:CD11c、CD80、CD86 和 MHC classⅡ，20 min后，清洗3次，細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀分析。

1.2.3DC趨化性實(shí)驗(yàn)利用96 transwell趨化小室(Chemo TX system，Neuro Probe，MD，USA)和聚碳酸酯濾器(孔徑5 μm)檢測DC細(xì)胞遷移能力。DC的成熟需要 LPS(1 mg·L－1)培養(yǎng) 24 h。成熟的 DC 以 5 × 108·L－1的數(shù)目用 15 μmol·L－1Carboxy Fluoroscein Succinimidyl Ester(CFSE)(Invitrogen，CA，USA)標(biāo)記20 min，然后沖洗2次。上層的隔室用有DC的200 μl細(xì)胞懸液RPMI 1640培養(yǎng)基，其中含有多種濃度的EM-1或-2，下層用含有 200 μg·L－1的趨化因子 CCL2、CCL3 和 CCL21(PeproTech)的0.5ml的培養(yǎng)基來填充。CTOP(25 μmol·L－1)，是Mu阿片受體的特異性拮抗劑，在內(nèi)嗎啡肽(10－6mol·L－1)添加30 min之前加入到上室。每種條件設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。完整的小室放置在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)90 min。培養(yǎng)之后，移除上層小室的細(xì)胞懸液，通過過濾器由上層遷移至下層小室的細(xì)胞可以用流式細(xì)胞儀完全計(jì)數(shù)。用下層小室中CSFE標(biāo)記的DC的平均熒光強(qiáng)度(MFI)來表示結(jié)果。

1.2.4T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的檢測采用3H-TdR參入法。取正常C57/BL6小鼠脾臟，制備無菌的脾細(xì)胞懸液，以完全培養(yǎng)基懸浮，注入T細(xì)胞尼龍毛柱，置37℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)1 h，沖出非黏附的細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞(即純化的T細(xì)胞)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至 1 ×109·L－1，加入 96 孔圓底培養(yǎng)板，100 μl/孔;與此同時(shí)，培養(yǎng)7 d的DC經(jīng)LPS刺激24 h，加入不同濃度的 EMs，或 CTOP 和 10－6mol·L－1的 EMs。處理的DC(5 000個(gè))與105純化的T細(xì)胞混合，并繼續(xù)培養(yǎng)72 h，加入1.85×104Bq［3H］胸腺嘧啶核苷(thymidine)，繼續(xù)培養(yǎng)18 h。收集細(xì)胞，液閃計(jì)數(shù)儀檢測cpm值，結(jié)果以3孔平均值表示。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Mann-Whitney U test用于比較不同試驗(yàn)組的不同。

2 結(jié)果

2.1EMs對(duì)DC表面分子表達(dá)的影響流式細(xì)胞儀的分析結(jié)果表明，CD11c陽性細(xì)胞純度達(dá)95%以上。當(dāng)用LPS刺激DC24h，細(xì)胞表面分子的表達(dá)上調(diào)。

LPS激活的DC加入不同濃度的EM-1/EM-2(10－6、10－8和 10－10mol·L－1)，活化的 DC 不加入EM-1/EM-2用作對(duì)照。經(jīng)過48 h的培養(yǎng)，檢測DC表面分子的變化。結(jié)果表明，DC的表面膜分子MHC classⅡ、CD80和CD86，與LPS活化的DC組相比，沒有明顯的改變(Tab 1，EM-1/EM-2 10－8mol·L－1和 10－10mol·L－1的結(jié)果也是沒有明顯的改變，數(shù)據(jù)未列出)。

Tab 1 Expression levels of surface molecules in DCs(±s，%，)

Tab 1 Expression levels of surface molecules in DCs(±s，%，)

imDC:Immature DCs;LPS:DCs cultured in the presense of LPS;＊＊P ＜0.01 vs imDC

Group MHC classⅡCD86 CD80 imDC 20.3 ±3.6 16.8 ±3.5 24.9 ±5.3 LPS 57.0 ±4.8＊＊ 62.8 ±6.7＊＊ 77.7 ±8.2＊＊LPS+EM-1(10 －6mol·L －1)52.4 ±6.1 64.2 ±6.8 76.7 ±9.1 LPS+EM-2(10 －6mol·L －1)53.9 ±4.4 61.4 ±7.8 75.5 ±6.4

2.2EMs抑制DC的趨化性為了證明EMs是否影響DC的趨化性，幾種細(xì)胞因子包括CCL2、CCL3和CCL21被放置在小室的底部作為化學(xué)引誘物。CSFE-標(biāo)記的 DC孵育在含有多種濃度EM-1/EM-2的上層孔室中，遷移到底部的DC的熒光強(qiáng)度可作為內(nèi)嗎啡肽對(duì)DC趨化性的抑制能力的評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示 EM-1 在濃度為10－6mol·L－1，EM-2 在濃度為10－7mol·L－1時(shí)，可以抑制 DC 的趨化性。預(yù)先CTOP處理，可以阻止這些內(nèi)嗎啡肽的抑制能力(Fig 1)。

2.3EMs處理的DC影響T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)DC的一個(gè)重要的功能就是指導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的活化和增殖，引導(dǎo)獲得性免疫的發(fā)展。由于T淋巴細(xì)胞可以表達(dá)Mu受體［9］，因此為了排除T細(xì)胞上的效應(yīng)，DC預(yù)先用LPS和多種濃度的激動(dòng)劑EM-1和EM-2共孵育24h，然后用PBS洗去LPS和EMs。沖洗過的DC和同種基因型的T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)3 d。用3H-胸腺嘧啶核苷的參入來反映T淋巴細(xì)胞的增殖。如Fig 2所示，EM-1(10－6mol·L－1)或 EM-2(10－8和 10－6mol·L－1)處理的樹突狀細(xì)胞在與 T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，T淋巴細(xì)胞的增殖呈現(xiàn)出濃度依賴性的抑制。EM-1(10－6mol·L－1)和 EM-2(＞10－8mol·L－1)明顯地降低了細(xì)胞增殖的程度。CTOP預(yù)處理樹突狀細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)不再降低，表現(xiàn)出與LPS活化的樹突狀細(xì)胞相似的增殖效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，經(jīng)EMs處理過的DC能抑制T淋巴細(xì)胞的增殖，這種抑制效應(yīng)是由Mu受體介導(dǎo)的(Fig 2)。

3 討論

EM-1和EM-2，作為內(nèi)源性阿片類物質(zhì)家族的一員，在1997年被Zadina等［1］發(fā)現(xiàn)。免疫細(xì)胞釋放的類阿片活性肽不僅可以作用在神經(jīng)元的阿片樣受體［10］，也可以作為有力的細(xì)胞內(nèi)免疫應(yīng)答的調(diào)控子影響免疫系統(tǒng)［11，20］，這表明了通過類阿片活性肽和它們的受體可以進(jìn)行雙向的阿片能的神經(jīng)免疫相互作用。近年來，越來越多的證據(jù)表明，EM-1和EM-2不僅參與炎癥反應(yīng)［12－13］，而且它們可通過改變細(xì)胞因子的產(chǎn)生，來改變腹腔巨噬細(xì)胞的功能［4－6］。DC和巨噬細(xì)胞相似，都屬于抗原提呈細(xì)胞，并且有文獻(xiàn)報(bào)道在人、鼠DC可表達(dá)Mu阿片受體［7］，而且我們以往的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)EM-1和EM-2在樹突狀細(xì)胞可誘導(dǎo)性表達(dá)［14］。但是，目前關(guān)于EMs對(duì)DC的調(diào)節(jié)作用尚未見相關(guān)報(bào)道。

Fig 1 Endomorphin-1 and endomorphin-2 inhibit DCs chemotaxis

DC是最有效的抗原提呈細(xì)胞，在激活靜止的T細(xì)胞和啟動(dòng)T細(xì)胞依賴的免疫應(yīng)答中起特殊作用［19］。未成熟DC在攝取抗原或接受到某些刺激因素(如 LPS、TNF-α)后，細(xì)胞表面 MHC-Ⅱ分子和協(xié)同刺激分子表達(dá)增加，逐漸分化成熟，并同時(shí)向淋巴器官遷移。成熟DC在其表面將加工處理的抗原肽/MHC復(fù)合物呈遞給T細(xì)胞，與T細(xì)胞相互作用發(fā)生免疫應(yīng)答，該過程還需要協(xié)同刺激分子的參與，其中，最重要的是T細(xì)胞表面CD28與DC表面相應(yīng)配體CD80和CD86的結(jié)合。因此，DC的成熟狀態(tài)關(guān)系到能否激發(fā)有效的獲得性免疫應(yīng)答。本研究也證明了LPS激活DC后，其表面分子MHC classⅡ、CD80和 CD86表達(dá)增加，但是加入不同濃度的EM-1/EM-2共培養(yǎng)后，DC表面分子的表達(dá)沒有明顯改變，提示EMs可能不影響DC的表型分子表達(dá)。

Fig 2 Treatment by EM-1 or EM-2 impair the T cell stimulatory capacity of mDC

DC啟動(dòng)免疫反應(yīng)的能力取決于它們特異的游走和向組織匯集的特點(diǎn)。DC可以有效的找到淋巴器官中T細(xì)胞區(qū)域，并與T細(xì)胞發(fā)生相互作用。在免疫應(yīng)答的發(fā)展中，DC趨化性的調(diào)節(jié)起到重要的作用。有文獻(xiàn)報(bào)道了嗎啡可以抑制單核細(xì)胞的趨化性，支持了在單核細(xì)胞趨化性中Mu阿片受體和嗎啡的調(diào)控作用［15］。近來的許多研究［12］也表明EM-1和EM-2可以抑制巨噬細(xì)胞的趨化性，并且具有抗炎作用。在本研究中，我們觀察到EM-1和EM-2可以抑制DC的趨化性，并且這種抑制作用可以被Mu阿片受體的特異性拮抗劑CTOP逆轉(zhuǎn)。我們的研究與EM-1和-2可以參與炎癥反應(yīng)或起始刺激的證據(jù)是一致的［16］。

DC的一個(gè)重要的功能就是指導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的活化和增殖，引導(dǎo)獲得性免疫的發(fā)展。由阿片肽引起的DC功能的變化，可以通過T細(xì)胞增殖來體現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)，我們首次報(bào)道EMs處理后的DC對(duì)T細(xì)胞增殖具有抑制效應(yīng)。這樣的抑制效應(yīng)可以歸結(jié)為在內(nèi)嗎啡肽處理后的DC中，抗炎的細(xì)胞因子IL-10的生成增加，和 IL-12、IL-23 的生成減少［17］。IL-12 主要由DC等在活化過程中產(chǎn)生、分泌，具有激活NK細(xì)胞、促進(jìn)T細(xì)胞增殖、促進(jìn)輔助性T細(xì)胞(T helper，Th)分化為 Th1 型細(xì)胞的作用［18］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雖然EM-1和EM-2不影響DC表面分子的表達(dá)，但是EM-1和EM-2抑制DC的趨化性，抑制了DC對(duì)T淋巴細(xì)胞的增殖能力，提示EM-1和EM-2可能抑制了DC對(duì)T淋巴細(xì)胞的激活作用。推測M-1和EM-2可以通過影響DC、巨噬細(xì)胞等的免疫功能，調(diào)節(jié)先天的和適應(yīng)性的免疫應(yīng)答。

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