李彩芳，楊建平，王麗娜，劉 磊，胡計(jì)嬅，劉思蘭

(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，江蘇蘇州 215006)

2002年第10屆世界疼痛學(xué)會(huì)將疼痛列為心率、血壓、體溫和呼吸后的第五大生命體征。疼痛，尤其是慢性疼痛，正越來(lái)越嚴(yán)重的影響著患者的生活質(zhì)量。在所有慢性疼痛患者中，最急需治療的是癌痛患者，因此，對(duì)癌痛的治療及產(chǎn)生機(jī)制的研究越來(lái)越重要。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulate kinase，ERK)是 MAPK家族中的一員，介導(dǎo)多種信號(hào)的胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)，已在不同的疼痛模型中發(fā)現(xiàn)磷酸化ERK表達(dá)增加，用其上游激酶MEK的阻滯劑能減輕模型大鼠的痛敏表現(xiàn)，提示其活性的變化與傷害性刺激的傳遞及神經(jīng)敏感化有關(guān)［1－2］。本研究擬觀察鞘內(nèi)注射絲裂原激活蛋白激酶激酶(MEK)阻滯劑U0126對(duì)骨癌痛(bone cancer pain，BCP)大鼠痛行為和脊髓背角磷酸化CREB(pCREB)表達(dá)的影響，探討ERK-CREB通路在骨癌痛中的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年♀Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量150～180 g，由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。許可證號(hào)SYXK(蘇)2007-0035。動(dòng)物在適應(yīng)環(huán)境1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)室光照時(shí)間08:00～20:00，溫度控制在(18～22)℃，濕度40% ～60%。單籠飼養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食。所有實(shí)驗(yàn)均在光照期間完成。

1.2主要藥品和儀器U0126(Sigma公司，USA);兔抗pCREB抗體、免疫組化試劑盒(Santa Cruz公司，USA)。Von-Frey毛針觸痛覺(jué)檢測(cè)儀 (BME-403，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所);Walker256細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室凍存;溶媒為5%二甲亞砜(DMSO)。

1.3方法

1.3.1建造大鼠骨癌痛模型按照本實(shí)驗(yàn)室方法［3］建立大鼠骨癌痛動(dòng)物模型，大鼠脛骨干骺端打孔向骨髓腔緩慢注入Walker256細(xì)胞懸液制作成功。術(shù)后分籠飼養(yǎng)。室溫維持20～25℃，自然照明，自由飲水和攝食。假模型組以相同容量Hanks液代替細(xì)胞懸液。

1.3.2大鼠脊髓蛛網(wǎng)膜下腔置管骨癌痛模型術(shù)后 2 d，大鼠用水合氯醛(350 mg·kg－1，ip)麻醉后，根據(jù)楊建平等［4］的方法并加以改進(jìn)，進(jìn)行蛛網(wǎng)膜下腔置管，采用L3～4法。大鼠單籠飼養(yǎng)。出現(xiàn)下肢跛行癱瘓、局部感染、活動(dòng)異常、導(dǎo)管脫落等異常的大鼠及其數(shù)據(jù)摒棄不用。

1.4第一部分分組和觀察指標(biāo)

1.4.1分組40只大鼠，隨機(jī)均分為5組(n=8):Ⅰ組在大鼠脛骨注Hanks液制作為假模型組，單次鞘內(nèi)注射10 μg U0126，組Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ在大鼠脛骨注腫瘤細(xì)胞制作骨癌痛動(dòng)物模型10 d后分別鞘內(nèi)注射 5% 二甲亞砜(DMSO)10 μl和 U0126 0.1、1、10 μg(均溶于 10 μl 5%DMSO)。

1.4.2行為學(xué)測(cè)定造模術(shù)前及術(shù)后1、3、5、7、9 d測(cè)定大鼠雙側(cè)后肢機(jī)械性縮足閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)。每天早、中、晚測(cè)3次，取平均值。鞘內(nèi)給藥后 1、3、6、9、24 h測(cè)定大鼠術(shù)側(cè)后肢的機(jī)械性縮爪閾值。機(jī)械性痛敏采用Chaplan等［5］的方法測(cè)定50%縮足閾值，大鼠適應(yīng)環(huán)境30 min后用一系列von Frey毛針觸痛覺(jué)檢測(cè)儀刺激雙側(cè)后肢足底中部，如大鼠在刺激時(shí)或移開(kāi)von Frey纖維絲時(shí)出現(xiàn)快速縮足或舔足反應(yīng)為陽(yáng)性反應(yīng)，每次間隔30 s，以15 g為上限。用天平和有機(jī)玻璃自制成大鼠后肢負(fù)重測(cè)量?jī)x，取兩后肢負(fù)重差(weight bearing different，WBD)，左右分別測(cè)量3次，兩次實(shí)驗(yàn)之間至少間隔5 min，取平均值［6］。

1.5第二部分分組和觀察指標(biāo)

1.5.1分組25只大鼠，隨機(jī)平分為5組(n=5):T1、T2和T3組在制作大鼠骨癌痛動(dòng)物模型10 d后，鞘內(nèi)注射 U0126 10 μg 后 1、6、24 h 處死大鼠取材，M組為模型對(duì)照組，鞘內(nèi)注射5%DMSO 10 μl后6 h處死大鼠，另5只在大鼠脛骨注Hanks液制作為假模型大鼠作為空白對(duì)照組(S組)，鞘內(nèi)注射5%DMSO 10 μl后6 h 處死取材。

1.5.2免疫組織化學(xué)采用免疫組織化學(xué)方法測(cè)定術(shù)側(cè)脊髓背角pCREB免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量。大鼠腹腔注射水合氯醛400 mg·kg－1深麻醉后，經(jīng)主動(dòng)脈灌注生理鹽水100 ml，4%多聚甲醛400 ml繼續(xù)灌注，取L4-5脊髓，在丙酮中后固定3 h。采用KEDEE KD-Ⅱ型冰凍切片機(jī)(浙江金華)將脊髓制成30 μm 切片，將切片收集在0.01·mol·L－1PBS中，破膜劑Triton×100破膜5 min，3%過(guò)氧化氫25 min，漂洗后5%正常羊血清室溫孵育，再漂洗后滴加兔抗pCREB(1∶400)(Santa Cruz公司，美國(guó))，4℃孵育24 h后，PBS沖洗，滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG，37℃孵育2 h后PBS沖洗，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，37℃孵育2 h后PBS沖洗，DAB顯色，貼片，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀察。陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，用PBS代替一抗或二抗。進(jìn)行pCREB陽(yáng)性神經(jīng)元計(jì)數(shù)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料以±s表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 MWT測(cè)定骨癌痛組(Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ)術(shù)后7 d及以后MWT較假模型組(Ⅰ)明顯下降。Ⅰ組大鼠鞘內(nèi)注射U0126 10 μg后對(duì)MWT沒(méi)有影響。Ⅳ組在用藥后6 h、Ⅴ組用藥后3、6 h和9 h與Ⅱ組MWT比較有明顯差異，提示鞘內(nèi)注射U0126 10 μg后可減輕骨癌痛所致的機(jī)械性痛敏，作用可持續(xù)至用藥后9 h。見(jiàn)Fig 1。

Fig 1 Changes of MWT in different time points before and after model made(±s，n=8)

2.2WBD測(cè)定Ⅰ組大鼠鞘內(nèi)注射U0126 10 μg后對(duì)WBD沒(méi)有影響。骨癌痛組(Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ)術(shù)后7 d及以后WBD較假模型組明顯增高。Ⅱ組鞘內(nèi)注射5%二甲亞砜10 μl后WBD無(wú)變化，Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組鞘內(nèi)應(yīng)用不同劑量U0126后3、6 h和9 h較用藥前時(shí)點(diǎn)的WBD減小，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用藥后24 h后與用藥前時(shí)點(diǎn)的WBD比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)Fig 2。

Fig 2 Changes of WBD in different time points before and after model made(±s，n=8)

2.3形態(tài)學(xué)免疫組化染色可見(jiàn)模型組大鼠與假模型組比較，脊髓背角內(nèi)pCREB免疫陽(yáng)性神經(jīng)元增多，且多為雙側(cè)全層分布，多數(shù)pCREB陽(yáng)性神經(jīng)元位于背角淺層。鞘內(nèi)注射10 μg U0126可以減少脊髓背角pCREB表達(dá)，于用藥后6 h表現(xiàn)最為明顯。見(jiàn) Fig 3、4。

Fig 3 Changes in the positive cell numbers of pCREB in dorsal horn of the spinal cord in rats(±s，n=5)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中，將腹水細(xì)胞傳代培養(yǎng)的Walker256癌細(xì)胞種植于同系的SD大鼠后肢脛骨上端骨髓腔以建立骨轉(zhuǎn)移性癌痛模型，造模術(shù)后7 d開(kāi)始患側(cè)出現(xiàn)MWT進(jìn)行性降低和WBD進(jìn)行性增高，呈現(xiàn)明顯的機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏和機(jī)械性痛覺(jué)超敏，提示模型制作成功。

以往的研究中，在不同的疼痛模型(辣椒素、完全氟氏佐劑致炎、內(nèi)臟痛、電刺激等)均發(fā)現(xiàn)ERK通路參與了中樞敏感化的形成和發(fā)展［2－3，6－8］。U0126是一種常用的MAPKK(有絲分裂素激活蛋白激酶激酶)抑制劑，它可以通透細(xì)胞，與MEK非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，抑制活化酶的催化活力，從而阻止ERK1/2(即p44/42 MAPK)的磷酸化和激活。有研究證實(shí)，在炎性痛和病理性痛大鼠模型，鞘內(nèi)注射MEK特異性阻滯劑U0126到背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元能夠抑制背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞體ERK的磷酸化［7－8］。在本研究中，根據(jù)文獻(xiàn)［7］選擇3種不同劑量U0126及其溶劑5%DMSO對(duì)大鼠進(jìn)行鞘內(nèi)注射，發(fā)現(xiàn)5%DMSO對(duì)大鼠痛行為沒(méi)有影響，10 μg U0126可以明顯降低MWT，鞘內(nèi)注射不同劑量U0126后對(duì)WBD的影響也有顯著性意義，由此可以看出，鞘內(nèi)注射較大劑量MEK特異性阻滯劑U0126可以明顯減輕大鼠的痛行為，由此也可證實(shí)ERK通路參與了骨癌痛。

ERK可以轉(zhuǎn)位進(jìn)入核內(nèi)磷酸化轉(zhuǎn)錄因子CREB，調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)［9］，從而在痛覺(jué)敏化中發(fā)揮作用。其機(jī)制可能在于ERK被激活后從胞質(zhì)移位到核內(nèi)，激活Rsk2，接著將Ser133中的轉(zhuǎn)錄因子CREB磷酸化，CREB磷酸化后與DNA上啟動(dòng)子區(qū)域中的cAMP反應(yīng)元件位點(diǎn)結(jié)合，進(jìn)而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄［10］。CREB作為一種核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，參與多種生物分子基因表達(dá)的調(diào)控，其中的如c-fos、內(nèi)啡肽、NK-1受體、COX-2、BDNF等的表達(dá)在各種傷害性刺激引起的脊髓神經(jīng)元長(zhǎng)時(shí)程可塑性變化中發(fā)揮重要作用［11－13］。本研究的免疫組化結(jié)果顯示，骨癌痛組大鼠脊髓背角pCREB表達(dá)較假模型組增多，鞘內(nèi)注射U0126能明顯抑制模型組大鼠脊髓pCREB表達(dá)的增多，這種作用在用藥后6 h最為明顯，可以推測(cè)CREB可能參與介導(dǎo)了骨癌痛。

本研究中，骨癌痛組大鼠鞘內(nèi)注射U0126后機(jī)械痛敏得到緩解，pCREB表達(dá)也明顯減少，但仍較假模型組高，這可能是由于其他機(jī)制如脊髓膠質(zhì)細(xì)胞的活化［14］等也參與了骨癌痛的形成有關(guān)。

綜上所述，ERK及其下游的CREB可能參與介導(dǎo)了大鼠骨癌痛的形成與維持。

Fig 4 Different expression of pCREB in the dorsal horn of spinal cord in rats

［1］Rygh L J，Tjolsen A，Hole K，et al.Cellular memory in spinal nociceptive circuitry［J］.Scand J Psychol，2002，43:153 －9.

［2］Ji R R，Woolf C J.Neuronal plasticity and signal transduction in nociceptive neurons:implications for the initiation and maintenance of pathological pain［J］.Neurobio Dis，2001，8:1 －10.

［3］姚 明，楊建平，王麗娜，等.腹水傳代與體外培養(yǎng)Walker 256癌細(xì)胞系建立大鼠骨癌痛模型的可行性［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2008，88(13):880 －4.

［3］Yao M，Yang J P，Wang L N，et al.Feasibility of establishment of rat model of bone cancer pain by using Walker 256 cells culturedin vitroorin vivo［J］.Nat Med J China，2008，88(13):880 －4.

［4］楊建平，蔣 豪，吳 玨.大鼠蛛網(wǎng)膜下腔埋管并長(zhǎng)期留置操作的改進(jìn)［J］.中華麻醉學(xué)雜志，1993，13(2):110 －2.

［4］Yang J P，Jiang H，Wu J.Improvement of burying and detaining tube for long time in rat subarachnoid space［J］.Chin J Anesthesiol，1993，13(2):110.

［5］Ji R R，Befort K，Brenner G J，et al.ERK MAP kinase activation in superficial spinal cord neurons induces prodynorphin and NK-1 upregulation and contributes to persistent inflammatory pain hypersensitivity［J］.Neurosci，2002，22(2):478 －85.

［6］Zhu C Z，Hsieh G，Ei-Kouhen O，et al.Role of central and peripheral mGluR5 receptors in post-operative pain in rats［J］.Pain，2005，114(1-2):195 －202.

［7］Seino D，Tokunaga A，Tachibana T，et al.The role of ERK signaling and the P2X receptor on mechanical pain evoked by movement of inflamed knee joint［J］.Pain，2006，123:193 －203.

［8］Ji R R.Mitogen-activated protein kinases as potential targets for pain killers［J］.Curr Opin Investig Drugs，2004，5(1):71 － 5.

［9］Hoeger-Bement M K，Sluka K A.Phosphorylation of CREB and mechanical hyperalgesia is reversed by blockade of the cAMP pathway in a time-dependent manner after repeated intramuscular acid injections［J］.Neurosci，2003，23:5437 －45.

［10］Lonze B E，Ginty D D.Function and regulation of CREB family transcription factors in thenervous system ［J］.Neuron，2002，35(4):605－23.

［11］White D M，Walker S，Brenneman D E，Gozes I.CREB contributes to the increased neurite outgrowth of sensory neurons induced by vasoactive intestinal polypeptide and activity dependent neurotrophic factor［J］.Brain Res，2000，868(1):31 －8.

［12］Miletic G，Pankratz M T，Miletic V.Increases in the phosphorylation of cyclic AMP response element binding［rotein(CREB)and decreases in the content of calcineyrin accompany thermal hyperalgesia following chronic constriction injury in rats［J］.Pain，2002，99(3):493－500.

［13］Milligan E D，Twining C，Chacur M，et al.Spinal glia and proinflammatory cytokines mediate mirror-image neuropathic pain in rats［J］.J Neurosci，2003，23(3):1026 －40.

［14］唐元章，申 文，劉 蘇，等.抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活對(duì)骨癌痛小鼠疼痛維持的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(1):104－8.

［14］Tang Y Z，Shen W，Liu S，et al.Inhibition of microglia activation affected the maintenance of cancer pain in a murine model［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(1):104 －8