鄧晶晶,袁青

?

針刺對(duì)胃腸平滑肌收縮粗肌絲調(diào)節(jié)機(jī)制的影響

鄧晶晶1,袁青2

(1.廣州市第八人民醫(yī)院中西醫(yī)科,廣州 510060;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院,廣州 510405)

觀察針刺對(duì)胃腸平滑肌收縮粗肌絲調(diào)節(jié)機(jī)制的影響,并分析此影響與針刺調(diào)整胃腸動(dòng)力的關(guān)系。將30只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組(行結(jié)腸吻合術(shù))和針刺組,每組10只。針刺組予每日針刺雙側(cè)足三針(足三里、三陰交、太沖),連續(xù)3 d。觀察各組大鼠小腸推進(jìn)率、核掃描胃液相排空實(shí)驗(yàn),取結(jié)腸組織檢測(cè)鈣調(diào)蛋白mRNA表達(dá)、肌球蛋白輕鏈激酶表達(dá)、平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)的變化。針刺組小腸推進(jìn)率、胃半排時(shí)間和排空率較模型組有所改善(＜0.01,＜0.05)。各組鈣調(diào)蛋白mRNA表達(dá)未見(jiàn)顯著性差異。結(jié)腸平滑肌肌球蛋白輕鏈激酶表達(dá)和平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)空白組最高,模型組明顯下降,而針刺組較模型組有所上升(＜0.05)。針刺促進(jìn)術(shù)后胃腸動(dòng)力的恢復(fù)可能與提高平滑肌收縮粗肌絲調(diào)節(jié)機(jī)制中的平滑肌肌球蛋白輕鏈激酶表達(dá)和平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)有關(guān),與鈣調(diào)蛋白mRNA表達(dá)無(wú)關(guān)。

針刺;鈣調(diào)蛋白;大鼠;肌球蛋白輕鏈激酶

平滑肌收縮裝置是一個(gè)收縮蛋白質(zhì)體系,依其功能分為收縮蛋白質(zhì)(肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白)、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)(鈣調(diào)蛋白、肌球蛋白輕鏈激酶、肌球蛋白輕鏈磷酸酶、原肌球蛋白)和細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)(結(jié)蛋白、波形蛋白)。現(xiàn)今公認(rèn)的調(diào)節(jié)平滑肌收縮的經(jīng)典機(jī)制為粗肌絲相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制,又稱為Ca2＋-鈣調(diào)蛋白-肌球蛋白輕鏈激酶依賴的機(jī)制[1]。主要機(jī)制為在Ca2＋的參與下,肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase,MLCK)催化肌球蛋白輕鏈(20kD myosin light chains,MLC20)磷酸化,磷酸化的肌球蛋白分解足夠的ATP,通過(guò)與肌動(dòng)蛋白的相互作用而產(chǎn)生收縮。

腹部術(shù)后由于受到手術(shù)麻醉創(chuàng)傷,術(shù)后禁食鎮(zhèn)痛、腹腔內(nèi)積血或引流管的機(jī)械刺激等綜合因素的作用,胃腸平滑肌的收縮功能常常出現(xiàn)紊亂,表現(xiàn)為術(shù)后腹脹腹痛,惡心嘔吐,排氣排便困難或腹瀉等胃腸運(yùn)動(dòng)功能障礙的一系列癥狀。針刺用于促進(jìn)術(shù)后胃腸運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)在臨床上已經(jīng)取得一定成效[2-4],但其作用機(jī)理尚未明確。本研究從調(diào)節(jié)平滑肌收縮的粗肌絲相關(guān)機(jī)制著手,探討針刺對(duì)其影響,分析此影響與針刺調(diào)整胃腸動(dòng)力的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

99mTc-DTPA(北京原子高科公司提供,放化純＞95%);Rabbit anti-MLCK(北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供),anti-SMA和即用型SABC兔IgG免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司提供);Trizol和RNA提取液、MMLV、Taq酶、dNTPs(達(dá)安生物工程有限公司提供);3900臺(tái)式高通量DNA合成儀、9700 PCR儀、7500全自動(dòng)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司提供);HC-3018R高速冷凍離心機(jī)(安徽科大創(chuàng)新公司提供);－80℃冰箱(日本Sanyo公司提供);Varicam型雙探頭可變角度單光子發(fā)射型計(jì)算機(jī)斷層顯像儀(SPECT),配平行孔低能高分辨型準(zhǔn)直器(以色列Elscimt公司提供);2135病理切片機(jī)(德國(guó)Leika公司提供);光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司提供)。

1.2 動(dòng)物分組及模型制備

SPF級(jí)健康SD大鼠30只,雌雄各半,體重250～300 g,由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(0055935)。按完全隨機(jī)法將其分為針刺組、模型組、空白組,每組10只。

腸腸吻合模型制備具體操作為,術(shù)前禁食禁飲12 h,10%水合氯醛腹腔注射麻醉(劑量為0.33 mL/ 100 g)。仰臥位固定,常規(guī)備皮、消毒,下腹正中切口,長(zhǎng)約2 cm;尋找到大鼠盲腸下2 cm處結(jié)腸,切斷后行原位縫合(一層縫合法);關(guān)腹。手術(shù)當(dāng)天禁食禁飲水,術(shù)后第1、2天流質(zhì)飲食,第3天核掃描后予標(biāo)準(zhǔn)鼠料,控制食量,按l6～20 g/(只·d)的1/3量供給,術(shù)后第4天處死檢測(cè)指標(biāo)。

1.3 穴位定位與針刺方法

取足三針,即雙側(cè)足三里、三陰交、太沖,定位參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》。針刺組動(dòng)物術(shù)后清醒即予針刺,采用0.18 mm×10 mm毫針直刺入穴位,每5 min緩慢提插捻轉(zhuǎn)2～3次,每日針刺1次,每次15 min。模型組、空白組每天同一時(shí)間放于固定器中15 min。療程為3 d。

1.4 核素掃描胃液相排空試驗(yàn)

術(shù)后第3天檢查前將大鼠禁食12 h,用安定4 mg/ kg行腹腔注射。予液體試驗(yàn)餐灌胃(液體試驗(yàn)餐由99mTc-DTPA和0.9%NS混合配制,灌胃劑量為1.5 mL試驗(yàn)餐/只,內(nèi)含0.1～0.2 mCi99mTc-DTPA)。將大鼠置入圓筒固定器,采用大鼠立位將圓筒固定器放置于檢測(cè)床上,調(diào)整低能通用型準(zhǔn)直器的探頭視野中心置于大鼠腹部,動(dòng)態(tài)連續(xù)采集,能峰160 keV,窗寬20,矩陣256×256,Zoom(放大倍數(shù))1.0,采集時(shí)間20 s/幀,共60 min。用計(jì)算機(jī)軟件(GASTRICEMPTYING)處理后獲得胃排空-時(shí)間曲線,通過(guò)曲線找出相對(duì)應(yīng)的胃半排時(shí)間(GET1/2),并計(jì)算胃60 min排空率。胃排空率=(總放射性-t時(shí)胃內(nèi)放射性K)/總放射性×100%。K為從時(shí)間0至t時(shí)的放射性衰變校正系數(shù)(此過(guò)程計(jì)算機(jī)自動(dòng)處理)。

1.5 小腸推進(jìn)率的測(cè)定

碳素墨水予大鼠灌胃1 mL/只,30 min后處死,用米尺測(cè)量小腸全長(zhǎng)(幽門至回盲部)以及標(biāo)記物在小腸從幽門向前推進(jìn)的距離(從幽門至炭末前沿的長(zhǎng)度)。計(jì)算標(biāo)記物推進(jìn)的距離占小腸全長(zhǎng)的百分比。

1.6 鈣調(diào)蛋白(calmodulin,CaM)mRNA的測(cè)定

取盲腸下2 cm處結(jié)腸(相當(dāng)吻合口處)組織100 mg,充分研磨,TRIzol(Gibco BRL,USA)一步法提取組織總RNA。取RNA模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,37℃1 h,然后95℃逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)滅活3 min。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加入PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中,93℃3 min,然后93℃30 s,55℃45 s,72℃45 s,共40循環(huán)。CaM1(擴(kuò)增片段長(zhǎng)度102 bp)的引物序列:5’-GACTGTCATGCGGTCACTGG-3’(上游), Reverse Primer為5’-TCTGGGAAGTCAATGGTGCC-3’ (下游)。內(nèi)參基因R-GAPDH(擴(kuò)增片段長(zhǎng)度134 bp)的引物序列為5’-TGGTCTACATGTTCCAGTATGACT-3’(上游),5’-CCATTTGATGTTAGCGGGATCTC-3’(下游)。由電腦自動(dòng)分析并計(jì)算結(jié)果(拷貝數(shù)/mL cDNA)?？紤]到各個(gè)樣本總RNA濃度的差異,按下列公式換算,A=B1(目的基因)/B2(內(nèi)參基因)。

1.7 肌球蛋白輕鏈激酶和平滑肌肌動(dòng)蛋白(smooth muscle actin,SMA)表達(dá)的測(cè)定

①取盲腸下2 cm處結(jié)腸(相當(dāng)吻合口處),去除內(nèi)容物,PBS漂洗,于10%福爾馬林中固定。②包埋,切片,脫蠟,梯度乙醇水化,加3%H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化酶,用檸檬酸行抗原修復(fù),滴加5%BSA封閉液室溫20 min,加一抗恒溫箱1 h,PBS漂洗后加二抗室溫20 min,PBS漂洗后加SABC液室溫20 min,PBS漂洗后DAB顯色,蘇木素復(fù)染,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,樹膠封片,閱片,照相。③相對(duì)表達(dá)量分析。對(duì)肌球蛋白輕鏈激酶表達(dá)采用分級(jí)判斷方法,(－)為無(wú)染色信號(hào);(＋)為染色信號(hào)呈細(xì)顆粒狀,色棕黃,陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)＜50%;(＋＋)為染色信號(hào)呈細(xì)顆粒狀,色棕黃,陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)＞50%;(＋＋＋)為染色信號(hào)呈粗顆粒狀或塊狀,色棕黑,陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)＜50%;(＋＋＋＋)為染色信號(hào)呈粗顆粒狀或塊狀,色棕黑,陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)＞50%。對(duì)平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)使用EIG綜合圖像分析軟件處理,用亮度值表示染色深淺,范圍值由0(深)～255 (淺)。每張切片均隨機(jī)選取3個(gè)視野,計(jì)算其平均亮度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料采用檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料比較用卡方檢驗(yàn)。以＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組胃半排時(shí)間與60 min排空率比較

由表1可見(jiàn),模型組胃半排時(shí)間、60 min排空率與空白組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。針刺組胃半排時(shí)間、60 min排空率與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01),提示針刺能促進(jìn)胃排空加快。針刺組胃半排時(shí)間、60 min排空率與空白組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05),提示術(shù)后3 d,在針刺作用下胃排空功能基本恢復(fù)正常。

表1 三組胃半排時(shí)間與60 min排空率比較 (±s)

注:與模型組比較1)＜0.01;與空白組比較2)＜0.05

2.2 小腸推進(jìn)率

由表2可見(jiàn),模型組小腸推進(jìn)率與針刺組和空白組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。針刺組小腸推進(jìn)率與空白組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05),表明針刺治療能提高小腸推進(jìn)率。

表2 三組小腸推進(jìn)率比較 (±s)

注:與模型組比較1)＜0.05;與空白組比較2)＜0.05

2.3 三組鈣調(diào)蛋白mRNA含量比較

針刺組、模型組和空白組胃腸組織CaM1 mRNA含量分別為(0.055±0.03)、(0.034±0.04)和(0.034±0.03),組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05),提示針刺調(diào)整術(shù)后胃腸平滑肌收縮粗肌絲調(diào)節(jié)可能不是主要通過(guò)改變胃腸組織的CaM1 mRNA含量而實(shí)現(xiàn)。

2.4 三組肌球蛋白輕鏈激酶的表達(dá)

空白組結(jié)腸平滑肌MLCK表達(dá)陽(yáng)性顆粒數(shù)量較多,色棕黃,達(dá)到(＋＋),模型組陽(yáng)性顆粒數(shù)量明顯減少,染色較淺,密度降低,分布稀疏,甚至消失,為(－～＋),而針刺組陽(yáng)性顆粒較模型組在數(shù)量、密度和染色程度方面均有所上升,為(＋＋)。詳見(jiàn)圖1。

圖1 結(jié)腸組織MLCK表達(dá)的免疫組化染色(SABC-DAB法,×200)

2.5 三組平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)

空白組結(jié)腸組織肌動(dòng)蛋白表達(dá)陽(yáng)性顆粒呈粗顆粒狀,深棕色,數(shù)量較多,灰度值為(90.33±0.18);模型組為陽(yáng)性顆粒顯著減少甚至消失,灰度值為(192.11±0.23);針刺組陽(yáng)性顆粒數(shù)量較模型組有所增加,分布較為稀疏,著色程度不如空白組,灰度值為(125.06±0.12)。與空白組比較,模型組結(jié)腸組織肌動(dòng)蛋白含量術(shù)后明顯下降(檢驗(yàn),＜0.05),而針刺組較模型組有所上升(檢驗(yàn),＜0.05)。詳見(jiàn)圖2。

圖2 結(jié)腸組織SMA免疫組化染色(SABC-DAB法,×200)

3 討論

Ca2＋是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中重要的第二信使物質(zhì),Ca2＋濃度的變化引起鈣調(diào)蛋白(CaM)構(gòu)象和活性的變化,進(jìn)一步激活含CaM結(jié)合位點(diǎn)的靶蛋白——Ca2＋/CaM依賴性蛋白激酶(Ca2＋/calmodulin dependent protein kinases,CaM Ks)和Ca2＋/CaM依賴性蛋白磷酸酶。CaMKs屬于絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶家族,肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)為其中一員。磷酸化酶激酶使磷酸化酶發(fā)生磷酸化,從而調(diào)節(jié)體內(nèi)物質(zhì)代謝。

肌球蛋白磷酸化學(xué)說(shuō)認(rèn)為[5-9],肌肉處于靜息態(tài)時(shí),細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度為0.2mmol/L,肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)分子折疊,催化域與“偽底物域”結(jié)合,呈非活性酶,肌球蛋白20kD輕鏈(MLC20)不能發(fā)生磷酸化,肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白無(wú)反應(yīng)。當(dāng)肌肉接受刺激發(fā)生興奮時(shí),胞外鈣離子內(nèi)流和肌漿網(wǎng)鈣離子釋放,細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度上升為0.6mmol/L,Ca2＋即與CaM結(jié)合進(jìn)而結(jié)合于MLCK成為三元體,使MLCK發(fā)生構(gòu)象變化而活化呈活性酶,催化MLC20的19位絲氨酸磷酸化,增加了肌球蛋白頭部的ATP酶活性,導(dǎo)致Mg2＋-ATP分解,由此產(chǎn)生的磷酸基結(jié)合于橫橋使其處于高自由能狀態(tài),啟動(dòng)橫橋循環(huán),粗、細(xì)肌絲相互滑動(dòng),肌肉收縮。

粗肌絲是組成肌節(jié)的肌球蛋白絲,而肌動(dòng)蛋白絲則是構(gòu)成細(xì)肌絲的核心。肌動(dòng)蛋白絲又稱纖維狀肌動(dòng)蛋白,為ATP驅(qū)動(dòng)的肌球蛋白提供運(yùn)動(dòng)軌道,傳遞張力,在細(xì)胞收縮、運(yùn)動(dòng)中起重要作用。故平滑肌肌動(dòng)蛋白含量對(duì)平滑肌的收縮能力具有較大影響[10]。

本研究對(duì)胃腸平滑肌收縮粗肌絲調(diào)節(jié)機(jī)制的重要分子如鈣調(diào)蛋白、肌球蛋白輕鏈激酶和肌動(dòng)蛋白進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果提示,鈣調(diào)蛋白mRNA在空白組、模型組和針刺組間沒(méi)有明顯改變。而平滑肌肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)表達(dá)和平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA)表達(dá)在結(jié)腸術(shù)后均有所下降(模型組與空白組比較,＜0.05),針刺能提高其表達(dá)(針刺組與模型組比較,＜0.05)。且MLCK和SMA表達(dá)增多的針刺組其小腸推進(jìn)率和核素掃描胃排空實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均好于模型組(＜0.05,＜0.01),與空白組無(wú)顯著性差異(＞0.05)。故由此可以推斷,針刺促進(jìn)術(shù)后胃腸動(dòng)力的恢復(fù)可能與其提高結(jié)腸平滑肌肌球蛋白輕鏈激酶表達(dá)和平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)有關(guān),與鈣調(diào)蛋白mRNA表達(dá)無(wú)關(guān)。

[1] 陳明,李愛(ài)媛.肌肉肌球蛋白,粗肌絲和Ca2＋調(diào)節(jié)機(jī)制的多樣性[J].生理科學(xué)進(jìn)展,1993,24(1):6-9.

[2] 宋建喬.針刺促進(jìn)腹部手術(shù)后胃腸功能恢復(fù)的臨床觀察[J].河北中醫(yī),2009,31(2):288,292.

[3] 周艷玲,張金成,黃錦萍.穴位低頻電刺激與穴位針刺對(duì)腸梗阻手術(shù)后胃腸蠕動(dòng)功能影響的比較[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2010,19 (18):2269,2274.

[4] 陳捷,孫立明,馬尚偉.針刺治療膽囊結(jié)石術(shù)后胃腸功能紊亂臨床觀察[J].上海針灸雜志,2010,29(5):298-299.

[5] De Lanerolle P, Paul RJ. Myosin phosphorylation dephosphorylation and regulation of airway smooth muscle contractility[J]. Am J Physiol, 1991,261(2pt1):1-14.

[6] 陳明,李愛(ài)媛.平滑肌肌球蛋白B的超沉淀與調(diào)節(jié)輕鏈磷酸化[J].生物化學(xué)雜志,1992,8(4):424-428.

[7] Kamm KE, Stull JT. Myosin phosphorylation,force,and maximal shortening velocity in neurally stimulated tracheal smooth muscle[J]. Am J Physiol, 1985,249(3pt1):238-247.

[8] Kamm KE, Stull JT. The function of myosin and myosin light chain kinase phosphorylation in smooth muscle[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 1985,25:593-620.

[9] Vale RD, Milligan RA. The way things move: looking under the hood of molecular motor proteins[J]. Science, 2000,288(5463):88-95.

[10] Halayko AJ, Salari H, MA X,. Marker of airway smooth muscle cell phenotype[J]. Am J Physiol, 1996,270(6Pt1):1040-1051.

Effect of Acupuncture on the Mechanism of Regulation of Thick Filaments During Gastrointestinal Smooth Muscle Contraction

-1,2.

1.,8’,510060,; 2.-,510405,

To investigate the effect of acupuncture on the mechanism of regulation of thick filaments during gastrointestinal smooth muscle contraction and analyze the relationship between the effect and acupuncture regulation of gastrointestinal motility.Thirty SD rats were randomly allocated to blank, model (colonic anastomosis was performed) and acupuncture groups, 10 rats each. In the acupuncture group, bilateral three leg points (Zusanli, Sanyinjiao and Taichong) were needled every day for three consecutive days. The intestinal propulsion rate was examinedand nuclear liquid phase gastric emptying scanwas taken in each group of rats. The colonic tissue was taken to examine the expressions of calmodulin mRNA, myosin light chain kinase and smooth muscle actin.The intestinal propulsion rate, and the gastric emptying half timeand emptying rate improved somewhat in the acupuncture group compared with the model group. There was no significant difference in the expression of calmodulin mRNA between the groups. The expressions of myosin light chain kinase and actin of colonic smooth muscles were highest in the blank group, decreased markedly in the model group and increased somewhat in the acupuncture group compared with the model group.That acupuncture promotes the postoperative recovery of gastrointestinal motility may be related to the expressions of smooth muscle myosin light chain kinase and actinin improving the mechanism of regulation of thick filaments during smooth muscle contraction and not related to the expression of calmodulin mRNA.

Acupuncture; Calmodulin; Rat; Myosin light chain kinase

1005-0957(2011)11-0783-04

R2-03

A

10.3969/j.issn.1005-0957.2011.11.783

2011-02-23

鄧晶晶(1982 - ),女,醫(yī)師,博士