趙現(xiàn)方,王艷婕,武忠偉,王振河,陳冰冰

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

2009 年墨西哥暴發(fā)流感疫情,并迅速向全球蔓延.中國衛(wèi)生部和世界衛(wèi)生組織向全球推薦達(dá)菲為抗甲型H1N1首選藥物之一[1],同時達(dá)菲也是禽流感的特效藥之一[2].莽草酸作為合成達(dá)菲的前體物也受到人們的重視.目前,莽草酸的制備方法有植物提取法[3]、化學(xué)合成法[4]、微生物代謝合成法[5].用植物提取法和化學(xué)合成法獲得莽草酸的成本較高,難以適應(yīng)大規(guī)模生產(chǎn)的要求.因此,微生物莽草酸代謝途徑,由較廉價碳源大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)莽草酸是解決市場需求的有效途徑.國外已有較多關(guān)于莽草酸生物合成方面的研究報道,主要的方法有2種：一種是阻斷由莽草酸激酶催化的莽草酸向下游代謝產(chǎn)物3-磷酸莽草酸（S3P）的轉(zhuǎn)化,如在大腸桿菌中敲除編碼莽草酸激酶的aroL和aroK基因或在芽孢桿菌中隨機(jī)敲除合成酶的aroA基因,使S3P積累,然后通過加熱或酸化將S3P轉(zhuǎn)化為莽草酸[6-9]；另一種是利用隨機(jī)突變的方法分別將枯草芽孢桿菌及弗羅因德（氏）枸櫞酸桿菌進(jìn)行突變,使莽草酸激酶失活從而獲得莽草酸工程菌[9],但是實(shí)際應(yīng)用于生產(chǎn)的還比較少.本課題組分離到一株莽草酸高產(chǎn)菌株,小試結(jié)果顯示可以達(dá)到68.01 mg/L（未發(fā)表數(shù)據(jù)）,在國內(nèi)處于領(lǐng)先水平.在此基礎(chǔ)上,本試驗(yàn)優(yōu)化該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基,以期能進(jìn)一步提高莽草酸的產(chǎn)量.

1 材料和方法

1.1 試劑及基礎(chǔ)培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：磷酸氫二鈉10 g/L,磷酸氫二鉀3 g/L,氯化鈉0.5 g/L,氯化銨1 g/L,葡萄糖4 g/L,pH7.2.

碳源培養(yǎng)基：分別利用葡萄糖,果糖,甘油,蔗糖,淀粉,羧甲基纖維素鈉代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖,并維持濃度不變.如此可以配制6種碳源培養(yǎng)基.

氮源培養(yǎng)基：分別利用牛肉膏,酵母膏,蛋白胨,豆餅粉,草酸銨,氯化銨,硫酸銨,硝酸鈉代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氯化銨,并維持濃度不變.如此可以配制8種碳源培養(yǎng)基.

磷酸水（2.87 g磷酸鈉加入800 mL的純水,用85℅（w/w）磷酸調(diào)pH至2.2）.

1.2 主要儀器

2010-CHT型高效液相色譜儀（日本島津公司）；ODC-C18反相色譜柱（SepaxTechnologiesIncorporation）.

1.3 莽草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

利用莽草酸標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司）分別配制質(zhì)量濃度為 0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mg/L的溶液.采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法[10-11]檢測莽草酸的含量.檢測波長為210 nm；柱溫設(shè)定為25℃；流動相為V（磷酸水）∶V（甲醇）＝98∶2；流速為 1 mL/min；每次進(jìn)樣 10 μL,峰值半保留時間 2.908 min.檢測結(jié)果由LC-Solution軟件統(tǒng)計分析,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.4 試驗(yàn)方法

上述6種碳源培養(yǎng)基和8種氮源培養(yǎng)基每種體積為90 mL.將活化菌種（本實(shí)驗(yàn)組自分離菌種,未命名）制成菌懸液,分別接種10 mL,并加30%草甘膦（安陽市安林化工有限公司）溶液10 mL.設(shè)定4個重復(fù).37℃,靜止發(fā)酵24 h.

發(fā)酵液通過離心（6 000 r/min,離心10 min）處理后,用苯對發(fā)酵液進(jìn)行除雜,再用孔徑為450 nm的膜過濾；最后采用高效液相色譜法,測定每個樣品,檢測條件同1.2.1,檢測結(jié)果同樣由LC-Solution軟件分析.數(shù)據(jù)由SPSS13.0軟件處理.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對莽草酸產(chǎn)量的影響

不同碳源對莽草酸產(chǎn)量的影響結(jié)果見表1.

表1 不同碳源對莽草酸產(chǎn)量的影響 mg/L

由表1可以看出,葡糖和果糖作為碳源,對莽草酸的產(chǎn)量影響最大,產(chǎn)量分別為1.43mg/L和1.50 mg/L.其次是雙糖的蔗糖,為0.34 mg/L.但對于甘油以及多糖的羧甲基纖維素鈉利用率較小,其產(chǎn)量分別僅為0.08和0.05 mg/L.該菌不能利用淀粉,說明它不能分泌胞外淀粉酶.從產(chǎn)量上看,葡萄糖和果糖產(chǎn)量較高,但是由于果糖價格太高,不適于作為后續(xù)大規(guī)模生產(chǎn)的碳源,所以采用葡萄糖作為后續(xù)試驗(yàn)碳源.

2.2 不同氮源對莽草酸產(chǎn)量的影響

不同氮源對莽草酸產(chǎn)量的影響結(jié)果見表2.

表2 不同氮源對莽草酸產(chǎn)量的影響 mg/L

由表2可以看出,以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵,莽草酸的產(chǎn)量達(dá)到134.58 mg/L,比其他氮源的影響大,且與其他氮源的影響具有顯著性差異.其次是牛肉膏,以牛肉膏為氮源,發(fā)酵后測得莽草酸含量為36.12 mg/L.以豆餅粉為發(fā)酵培養(yǎng)基,莽草酸產(chǎn)量較低,為1.48 mg/L,這可能與豆餅粉的溶解度有關(guān).但是,同為天然混合氮源的酵母膏對莽草酸的產(chǎn)量影響甚微,發(fā)酵結(jié)果顯示其產(chǎn)量為0.70 mg/L,這可能與酵母膏中含有某些抑制莽草酸產(chǎn)生的物質(zhì)有關(guān).在無機(jī)氮源中,氯化銨和硫酸銨對莽草酸的產(chǎn)量影響較大,產(chǎn)量分別達(dá)到了2.36 mg/L和1.22 mg/L.其次是硝酸鈉和草酸銨,產(chǎn)量分別為0.53 mg/L和0.40 mg/L.綜合考慮各種因素,后續(xù)試驗(yàn)將以蛋白胨作為氮源.

3 小結(jié)

本試驗(yàn)通過對培養(yǎng)基成分的單因素優(yōu)化試驗(yàn),選取葡萄糖作為碳源,選取蛋白胨作為氮源.因此培養(yǎng)基的基本成分分別為：葡萄糖、蛋白胨、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、氯化鈉.每種成分的濃度將通過后續(xù)的試驗(yàn)獲得.

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