齊娜,陳娜,陳軍,田園,張裕平

（1.河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003；2.河南工業(yè)大學(xué),河南鄭州450052）

三聚氰胺是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機化合物,重要的氮雜環(huán)有機化工原料.最主要的用途是作為生產(chǎn)三聚氰胺甲醛樹脂的原料.由于采用估測食品和飼料工業(yè)蛋白質(zhì)含量方法的缺陷,三聚氰胺常被不法商人摻進食品或飼料中,以提升食品或飼料檢測中的蛋白質(zhì)含量指標(biāo),因此三聚氰胺也被作假的人稱為“蛋白精”.近年來發(fā)生的國內(nèi)嬰兒奶粉受三聚氰胺污染導(dǎo)致嬰兒腎結(jié)石事件以及美國的數(shù)起飼料致死寵物的事件,使三聚氰胺的檢測成為關(guān)注熱點.目前對于三聚氰胺的檢測方法有很多,諸如毛細(xì)管電泳[1-2]、氣相色譜-質(zhì)譜法[3-4]、微流毛細(xì)管液相色譜法[5]等.這些方法都很繁瑣,儀器復(fù)雜.在此背景下,新的檢測技術(shù)或樣品預(yù)處理方法被積極開發(fā)出來,分子印跡技術(shù)就是其中的一項技術(shù).

分子印跡技術(shù)是制備具有分子識別能力聚合物的技術(shù)[6-8].分子印跡聚合物（molecularimprintingpolymers,MIP）是將模板分子與交聯(lián)劑在聚合物單體溶液中進行聚合得到固體介質(zhì),然后通過物理或化學(xué)方法洗脫除去介質(zhì)中的模板分子,得到“印跡”有目標(biāo)分子空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點的高分子聚合物[9].本文先用模板分子（三聚氰胺）與功能單體（MAA）通過共價鍵或非共價鍵結(jié)合,制備出配合物,然后和交聯(lián)劑EDMA反應(yīng)生成高聚物,最后將模板分子從聚合物中除去,制得三聚氰胺分子印跡聚合物,再將制得的印跡聚合物制備成固相萃取柱,優(yōu)化上樣、淋洗、洗脫等固相萃取步驟,篩選出三聚氰胺分子印跡固相萃取柱的最佳固相萃取條件.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

甲基丙烯酸、辛烷磺酸鈉、乙二醇二甲基丙烯酸酯購自百靈威公司；光引發(fā)劑Irgacure 1800購自Ciba公司；三聚氰胺購自天津市博迪化工有限公司；偶氮二異丁腈、檸檬酸、氫氧化鈉、甲苯、異辛烷、十二烷基磺酸鈉、甲醇、冰乙酸、氨水均為分析純,購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；實驗用水均為二次蒸餾水；乙腈、甲醇均為色譜純,購自天津市福晨化學(xué)試劑廠.

Agilent1100型高效液相色譜儀（Agilent Technologies,USA）；固相萃取裝置、氮吹儀（美國Supelco公司）；UV-2100雙光束紫外-可見分光光度計（北京瑞利分析儀器有限公司）；GM-0.5A型隔膜真空泵（天津市津騰實驗設(shè)備有限公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（河南智誠科技發(fā)展有限公司）.

1.2 三聚氰胺分子印跡聚合物的制備

將0.15 g三聚氰胺與0.4 mLMAA溶解于玻璃瓶中,再加入交聯(lián)劑EDMA 3.76 mL,超聲5 min后,加入6.5 mL甲苯和1.5 mL異辛烷,超聲混勻,50℃下攪拌該混合物至均勻,熱聚合加入0.04 g熱引發(fā)劑AIBN（光聚合加入0.04 g光引發(fā)劑Irgacure 1800）,攪拌至溶液均勻,充氮氣5 min,除去溶解氧,密封,在65℃恒溫水浴中聚合24 h,得到白色塊狀聚合物（反應(yīng)原理見圖1）.

圖1 三聚氰胺分子印跡聚合物的聚合反應(yīng)原理

聚合物研磨,過200～400目的篩（保留47～74 μm的顆粒）,之后用甲醇-乙酸（體積比 9∶1）洗去模板分子,洗脫液至紫外檢測不到三聚氰胺為止,再用甲醇洗去乙酸至溶液呈中性,用甲醇反復(fù)沉降2～3次,除去顆粒極小的懸浮粉末,得到三聚氰胺分子印跡聚合物,室溫真空干燥至恒重.空白聚合物除不加三聚氰胺目標(biāo)物外,其余與印跡聚合物的制備方法相同.光聚合分子印跡聚合物和空白聚合物的制備與熱引發(fā)聚合物的制備,僅僅只是引發(fā)劑不同,其他條件均相同.

1.3 三聚氰胺分子印跡固相萃取柱的制備

稱取20 mg助濾劑以及粒徑為47～74 μm的熱（光）引發(fā)聚合的三聚氰胺分子印跡聚合物和空白聚合物各60 mg,到3 mL帶有濾板的SPE空管柱中,制成三聚氰胺MI-SPE.考察不同的上樣、淋洗和洗脫條件下MI-SPE柱對三聚氰胺的保留能力.三聚氰胺的上樣濃度為10.0 mg/L,上樣5 mL,收集洗脫液,N2吹后,用流動相（離子對/乙腈=84/16（V/V））定容到5 mL,用HPLC測定.同時用空白聚合物制備非印跡固相萃取柱作對照實驗.

1.4 高效液相色譜測定三聚氰胺的色譜條件

用 YMCC18色譜柱（150 mm×4.6 mm,4 μm）,流動相為離子對 /乙腈（V/V=84/16）（離子對配制：準(zhǔn)確稱取2.10 g檸檬酸和2.16 g辛烷磺酸鈉,加入950 mL水溶解,調(diào)節(jié)pH=3.0后,定容到1 L）,柱溫為20℃,流速為1.0 mL/min,進樣量為20 μL,檢測波長為220 nm.

2 結(jié)果與討論

2.1 三聚氰胺分子印跡聚合物模版的去除

聚合完成后需將印跡孔穴中的模板分子從聚合物中洗脫出來.模板分子的洗脫對于后面測量分子印跡聚合物的吸附能力、選擇性及固相萃取至關(guān)重要.對于非共價型MIPs,模板與聚合物母體間靠較弱的氫鍵或離子作用等非共價鍵結(jié)合,一般采用乙腈、水、甲醇-乙酸（或三氟乙酸）、乙腈-乙酸等高極性溶劑反復(fù)洗滌即可除去模板分子,而最常用的方法是傳統(tǒng)的索氏提取法,此法不但費時,而且消耗試劑量比較大.

本實驗室采用超聲、離心和高壓沖洗相結(jié)合的方式來洗脫模板分子.此方法能節(jié)省試劑、縮短洗滌時間、減低聚合物損失、保證徹底洗脫干凈.

超聲波+離心機洗脫法是取適量聚合物加定量的洗脫液（甲醇/乙酸=9/1,V/V）,在超聲波清洗器上超聲10 min,隨后用離心機以4 000 r/min離心10 min至上清液澄清,除去洗脫液,吸取適量上清液用紫外-可見光度法在適當(dāng)波長下（200～240 nm）進行測定.照此步驟反復(fù)洗3～5次,直至洗脫液中檢測不到模板分子（當(dāng)吸光度達到小數(shù)點后1位為零時）,可認(rèn)為基本上洗脫干凈,最后按上述方法用甲醇洗脫3～5次,以除去過量的乙酸.

高壓沖洗,則是取適量聚合物,裝進不銹鋼管柱,再將鋼管柱放到高壓泵上,用甲醇/乙酸（9/1,V/V）沖洗聚合物,連續(xù)沖洗30 min后,再將柱子換方向沖洗30 min,吸取適量上清液用紫外-可見光度法在適當(dāng)波長下（200～240 nm）進行測定.反復(fù)沖洗幾次,直到洗脫液體中檢測不出模板分子,之后用甲醇沖洗,以除去過量乙酸.

2.2 三聚氰胺分子印跡固相萃取柱萃取條件的優(yōu)化

分別制備出三聚氰胺MI-SPE熱和MI-SPE光后,進行固相萃取條件的優(yōu)化（見表1）,選擇出最佳固相萃取條件,以便能更好的檢測三聚氰胺.

表1 三聚氰胺分子印跡聚合物固相萃取條件優(yōu)化

（續(xù)表）

結(jié)果表明,用甲醇淋洗MI-SPE和NI-SPE,回收率的損失都大于用甲苯淋洗,但是用甲苯淋洗,除去雜質(zhì)的能力較低,所以選用3 mL甲苯、3 mL甲醇、3 mL水依次進行淋洗.分別用5 mL不同比例的氨化甲醇溶液（3%,5%,8%,10%,12%,V/V）做洗脫液.隨著氨水比例的增加,回收率也依次增加,氮吹的時間也隨著增加.選用5 mL體積分?jǐn)?shù)為8%的氨化甲醇作為洗脫液時,氮吹的時間適中,且MI-SPE熱和MI-SPE光的回收率均在90%以上.

2.3 三聚氰胺液相色譜條件的選擇

2.3.1 檢測波長的選擇 在不同波長下對三聚氰胺進行液相色譜檢測,發(fā)現(xiàn)三聚氰胺在200～240 nm范圍有較大吸收.但在240 nm和230 nm處的出峰時間太慢,而在220 nm處,出峰快且峰形好（如圖2）.最終選擇220 nm作為三聚氰胺液相分析的波長.

2.3.2 流動相的選擇 常用做反相流動相的溶劑是甲醇和乙腈,但是甲醇活性高,可能與某些樣品發(fā)生反應(yīng),而且甲醇在低波長下有紫外吸收,會降低分析方法的靈敏度；乙腈洗脫能力比甲醇強,很少與樣品發(fā)生反應(yīng),用作流動相系統(tǒng)壓力要比甲醇低很多,所以這里我們選擇用乙腈.

對流動相的優(yōu)化主要在水相上下功夫,水里可以加酸、加堿、加鹽,從而改善峰形、提高分離度.流動相里加堿的情況比較少,主要還是加酸,在單獨用酸不行的時候就要使用緩沖鹽,用緩沖鹽做流動相時,出峰太早、峰形很差、結(jié)構(gòu)相似化合物的峰,因為拖尾或峰型太寬而不能達到基線分離時,要使用離子對試劑.

乙腈和離子對的比例調(diào)節(jié)至關(guān)重要,乙腈含量少時,出峰時間特別慢；離子對含量少時,雖然出峰時間較短,但峰形很差,甚至分離不開.實驗最終選擇離子對/乙腈=84/16作為流動相（見圖3）.在此條件下的色譜圖,出峰快,分離效果好.

圖2 不同檢測波長下的三聚氰胺液相色譜

圖3 不同流動相配比下的三聚氰胺液相色譜

2.3.3方法的線性范圍和檢出限 按試驗方法分別對0.2,1,2,4,6,8,10,12 mg/L三聚氰胺系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進行測定,結(jié)果表明：三聚氰胺質(zhì)量濃度在0.2～112 mg/L范圍內(nèi),濃度與峰面積呈線性關(guān)系.方法的檢出限（3S/N）為0.1 mg/L.

2.3.4 三聚氰胺分子印跡固相萃取柱洗脫液的檢測將5 mL、10.0 mg/L的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液,依照固相萃取過程分別通過三聚氰胺MI-SPE熱和MI-SPE光后,收集洗脫液,按照1.4節(jié)的條件進行三聚氰胺的液相色譜檢測,測得三聚氰胺MI-SPE熱和MI-SPE光與空白柱洗脫液的色譜圖見圖4.

三聚氰胺MI-SPE對含有10.0 mg/L的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進行富集,吸附能力較強,洗脫后分別計算MI-SPE熱和MI-SPE光的回收率,并進行比較,結(jié)果見表2.

圖4 三聚氰胺分子印跡固相萃取柱與空白柱洗脫液色譜

表2 三聚氰胺MI-SPE熱和MI-SPE光回收試驗

由圖4和表2可看出,MI-SPE熱和MI-SPE光對三聚氰胺均有較好印跡效果,且MI-SPE光的印跡效果又明顯好于MI-SPE熱的印跡效果.

3 結(jié)論

以三聚氰胺為模板分子,采用分子印跡技術(shù)分別合成三聚氰胺MIP光和MIP熱,用這兩種聚合物制備的固相萃取柱對三聚氰胺均呈現(xiàn)高的選擇結(jié)合特性.洗脫液回收率試驗表明,MI-SPE光的印跡效果高于MI-SPE熱的印跡效果.

[1]霍利,呂運開,丁天惠.高效毛細(xì)管電泳濁度法檢測牛奶及奶粉中的三聚氰胺[J].化學(xué)分析計量.2010,19（1）：36-39.

[2]袁旗,劉佳伶,杜建中.高效毛細(xì)管電泳法分離測定飼料中三聚氰胺含量[J].湛江師范學(xué)院學(xué)報.2010,31（6）：108-111.

[3]朱馨樂,劉琪,李丹,等.氣相色譜-質(zhì)譜法測定雞肉中殘留的環(huán)丙胺嗪及其代謝物三聚氰胺[J].色譜,2009,27（4）：401-405.

[4]Xia X,Ding S Y,Li X W,et al.Validation of a confirmatory method for the determination of melamine in egg by gas chromatography-mass spectrometry and ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Analytica.chimica.Acta,2009,651（2）：196-200.

[5]鄧璞紅,張裕平,魏新軍.自組裝微流高效液相色譜法測定奶粉中三聚氰胺[J].河南科技學(xué)院學(xué)報：自然科學(xué)版,2010,38（3）：71-74.

[6]陳長寶,周杰,吳春輝.分子印跡技術(shù)研究進展[J].化學(xué)研究與應(yīng)用,2006,18（8）：896-902.

[7]丁曉冬.新型傳感器的研究進展[J].科技資訊,2007,20（7）：26-27.

[8]姜忠義,吳洪.分子印跡技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2003：1-5.

[9]WulffG.Molecular imprintingin cross-linked materials with the aid ofmolecular templates-a way towards artificial antibodies[J].Chem.Int.Ed.,1995,34（17）：1812-1832.