逯艷云,王芳,李雪,李小六,胡厚勇,胡薛英,王新華

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué),湖北武漢430070；2.河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003；3.河南黑馬動物藥業(yè)有限公司,河南鄭州450003；4.濟(jì)源市第一職業(yè)高中,河南濟(jì)源454691；5.中國人民解放軍71697部隊(duì),河南衛(wèi)輝453100）

天一圓藍(lán)瘟毒康對家兔細(xì)胞免疫功能的影響

逯艷云1,王芳2,李雪3,李小六4,胡厚勇5,胡薛英1,王新華2

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué),湖北武漢430070；2.河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003；3.河南黑馬動物藥業(yè)有限公司,河南鄭州450003；4.濟(jì)源市第一職業(yè)高中,河南濟(jì)源454691；5.中國人民解放軍71697部隊(duì),河南衛(wèi)輝453100）

為研究天一圓藍(lán)瘟毒康（復(fù)方黃芪多糖注射液）對家兔細(xì)胞免疫功能的影響,利用E玫瑰花環(huán)試驗(yàn)檢測了家兔正常Et-花環(huán)形成率、Ea-花環(huán)形成率、藥物體外作用后Ea-花環(huán)形成率以及體內(nèi)用藥后24 h Ea-花環(huán)形成率.結(jié)果表明：家兔Et-花環(huán)正常值為67.90%±2.45%,Ea-花環(huán)正常值為48.72%±4.37%；天一圓藍(lán)瘟毒康體外試驗(yàn)Ea-花環(huán)形成率為61.66%±1.39%,體內(nèi)試驗(yàn)Ea-花環(huán)形成率69.03%±0.99%,均有明顯升高.天一圓藍(lán)瘟毒康對動物細(xì)胞免疫功能的提高具有十分明顯的作用,為該制劑的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù).

圓藍(lán)瘟毒康；細(xì)胞免疫；E-玫瑰花環(huán)；Et-花環(huán)；Ea-花環(huán)

淋巴細(xì)胞是動物機(jī)體重要的免疫細(xì)胞,它肩負(fù)著產(chǎn)生抗體和各種淋巴因子的作用,是動物機(jī)體抗御疾病的重要防線.淋巴細(xì)胞根據(jù)功能能和形態(tài)又分為B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞.其中T淋巴細(xì)胞（簡稱T細(xì)胞）掌管著細(xì)胞免疫和體液免疫的調(diào)控作用.T淋巴細(xì)胞是一個(gè)具有多功能的細(xì)胞群體.T細(xì)胞表面的CD2分子是綿羊紅細(xì)胞（SRBC）的受體[1].此試驗(yàn)方法既可檢測T細(xì)胞數(shù)量,又能反映T細(xì)胞的活性,從而可以判定機(jī)體的細(xì)胞免疫水平.在4℃條件下試驗(yàn)作用2 h形成的玫瑰花環(huán),代表T細(xì)胞的總數(shù),稱為Et-花環(huán).不經(jīng)4℃反應(yīng)立即形成的花環(huán),稱為活性花環(huán)（Ea-花環(huán)）,Ea-花環(huán)的數(shù)量變化可以反映人或動物機(jī)體的細(xì)胞免疫水平的變化.37℃30 min形成的花環(huán)稱為穩(wěn)定花環(huán),代表未成熟的T淋巴細(xì)胞.

應(yīng)用E玫瑰花環(huán)試驗(yàn)可以檢測機(jī)體的免疫狀態(tài)[2-3],從而可以幫助闡明發(fā)病機(jī)理,為臨床診斷和治療提供依據(jù).活性T細(xì)胞更能反映出機(jī)體的的細(xì)胞免疫水平,Ea-花環(huán)增多,表明細(xì)胞免疫功能增強(qiáng),也就是抗病能力增強(qiáng).因此,本試驗(yàn)可用于檢測動物機(jī)體的免疫狀態(tài)[4-5]、檢測藥物對機(jī)體細(xì)胞免疫功能影響[6-11]、評價(jià)藥物的療效、檢測生物制品的活性等[9,11].本文旨在通過E-玫瑰花環(huán)試驗(yàn)檢測考核中藥針劑天一圓藍(lán)瘟毒康對家兔細(xì)胞免疫功能的影響,為該藥品的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

天一圓藍(lán)瘟毒康（復(fù)方黃芪多糖注射液）,河南黑馬動物藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批號20101102,由河南黑馬動物藥業(yè)有限公司提供；試驗(yàn)家兔由河南科技學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院動物室提供,體重2.5 kg左右；綿羊血采自當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶羊群；Hanks液自配；紅細(xì)胞裂解液根據(jù)資料進(jìn)行改進(jìn)自配；瑞氏染色液自配；藥品試劑：戊二醛、檸檬酸鈉、檸檬酸、葡萄糖、氯化鈉、氯化鉀、碳酸氫鈉、十二水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化銨、碳酸氫鉀、Na2EDTA等,所有藥品、試劑均為分析純.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試劑配制

阿氏紅細(xì)胞保存液配制：檸檬酸鈉0.8 g、檸檬酸0.55 g、葡萄糖2 g、氯化鈉0.42 g、蒸餾水加至100 mL.115℃,10 min滅菌,4℃保存.可用7～10 d.血液：阿氏液的比例1∶1～1∶2.用阿氏紅細(xì)胞保存液保存的血液可用一周左右.

pH7.2～7.4無鈣鎂Hanks液配制：氯化鈉9 g、氯化鉀0.4 g、碳酸氫鈉0.35 g、磷酸氫二鈉（12結(jié)晶水）0.152 g、磷酸二氫鉀0.06 g、葡萄糖1 g、蒸餾水1 000 mL,調(diào)pH至7.2～7.4,115℃,10 min高壓滅菌, 4℃保存?zhèn)溆?

pH7.2～7.4紅細(xì)胞裂解液配制：10%氯化銨4 mL、25%碳酸氫鉀0.2 mL、20%Na2EDTA 0.1 mL、蒸餾水20.7 mL,共計(jì)25 mL.以上成分分別配制,臨用前按比例混合即成,配置的混合液可用一周.

0.8 %戊二醛配制：25%戊二醛0.46 mL、Hanks液19.36 mL,共計(jì)20 mL.現(xiàn)用現(xiàn)配.

1.2.2 1%綿羊紅細(xì)胞的制備新鮮3.8%檸檬酸鈉抗凝綿羊全血經(jīng)pH7.2Hanks液4次洗滌,每次3000 r/min 5min.最后用pH7.2Hanks液配制成1%紅細(xì)胞懸液備用.用前混勻,4℃保存可用一周.阿氏紅細(xì)胞保存液保存的綿羊全血處理方法相同.

1.2.3 家兔淋巴細(xì)胞的制備家兔耳靜脈采血,3.8%檸檬酸鈉抗凝.取0.1 mL置1.5 mL離心管中,加1 mL紅細(xì)胞裂解液,室溫作用2～3 min,待完全透明后,立即3 000 r/min離心5 min,傾倒出上清液,盡量吸出液體,僅留殘液,加入Hanks液1 mL,3 000 r/min離心5 min,傾倒出上清液,再重復(fù)1次,一般洗滌2次即可,洗滌次數(shù)多可導(dǎo)致淋巴細(xì)胞變性失活.盡量吸出上清液,殘液即為淋巴細(xì)胞液.家兔淋巴細(xì)胞現(xiàn)用現(xiàn)制備.

1.2.4 玫瑰花環(huán)（Et-花環(huán)、Ea-花環(huán)）正常值測定

Et-玫瑰花環(huán)形成試驗(yàn)：在制備好的家兔淋巴細(xì)胞懸液中加入50 μL 1%綿羊紅細(xì)胞懸液充分混勻, 4℃作用2 h,500 r/min離心5 min,盡量吸去上清液,殘液加0.8%戊二醛50 μL,4℃固定15～20 min,輕輕叩擊離心管或反復(fù)用滴管吹吸將其混勻,涂片,自然干燥,甲醇固定1 min,瑞氏染液染色1 min,滴加等量常水再染1～2 min,鏡檢.凡結(jié)合3個(gè)以上紅細(xì)胞的淋巴細(xì)胞算1個(gè)花環(huán),每張片子計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞,應(yīng)觀察兩張片子,按下式計(jì)算Et-花環(huán)形成率：

Et-花環(huán)形成率＝花環(huán)形成細(xì)胞數(shù)÷200×100%

Ea-花環(huán)形成試驗(yàn)：方法基本同上,只是在淋巴細(xì)胞懸液中加入綿羊紅細(xì)胞后立即500r/min離心5 min,吸去上清液,加0.8%戊二醛50 μL,4℃固定15～20 min,輕輕將其混勻,涂片,自然干燥,甲醇固定1 min,瑞氏染液染色1 min,滴加常水再染1～2 min,鏡檢.凡結(jié)合3個(gè)以上紅細(xì)胞的淋巴細(xì)胞算1個(gè)花環(huán),每張片子計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞,按下式計(jì)算Ea-花環(huán)形成率：

1.2.5 天一圓藍(lán)瘟毒康對Ea-花環(huán)形成率影響的體外試驗(yàn)

淋巴細(xì)胞激活：在淋巴細(xì)胞懸液中加入用生理鹽水10倍稀釋的天一圓藍(lán)瘟毒康100 μL,37℃孵育15 min,加入50 μL綿羊紅細(xì)胞懸液,立即500 r/min離心5 min,吸去上清液,加0.8%戊二醛50 μL,4℃固定15～20 min,輕輕將其混勻,涂片,自然干燥,甲醇固定1 min,瑞氏染液染色1 min,滴加常水再染1～2 min,鏡檢.凡結(jié)合3個(gè)以上紅細(xì)胞的淋巴細(xì)胞算1個(gè)花環(huán),每張片子計(jì)數(shù)200淋巴細(xì)胞,按下式計(jì)算Ea-花環(huán)形成率：

體外Ea-花環(huán)增長率＝（體外處理后Ea-花環(huán)形成率-處理前Ea-花環(huán)形成率）÷處理前Ea-花環(huán)形成率×100%

1.2.6 天一圓藍(lán)瘟毒康對Ea-花環(huán)形成率影響的體內(nèi)試驗(yàn)按0.2 mL/kg體重,給試驗(yàn)家兔皮下注射天一圓藍(lán)瘟毒康原液,注射后24 h耳靜脈采血,按2.2.2所述方法進(jìn)行試驗(yàn).

2 結(jié)果與分析

本次試驗(yàn)共用10只家兔,分別按2.2.1和2.2.2檢測Et-花環(huán)和Ea-花環(huán).并用同一份血樣按2.3作體外試驗(yàn).以檢測試驗(yàn)家兔正常T淋巴細(xì)胞數(shù)值、活性T淋巴細(xì)胞數(shù)值和藥物作用15 min后活性T淋巴細(xì)胞數(shù)值.然后按2.4作體內(nèi)試驗(yàn).每項(xiàng)試驗(yàn)每只家兔均作兩張涂片,每張片子計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞,最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理.結(jié)果如表1所示.

表1 試驗(yàn)前后E花環(huán)的數(shù)據(jù)

由表1可見,家兔正常Et-花環(huán)和Ea-花環(huán)的形成率分別為67.90%±2.45%和48.72%±4.37%.經(jīng)天一圓藍(lán)瘟毒康處理后,家兔體外試驗(yàn)Ea-花環(huán)形成率為61.66%±1.39%,Ea-花環(huán)的增長率為26.55%；給試驗(yàn)家兔皮下注射天一圓藍(lán)瘟毒康原液24 h后,Ea-花環(huán)形成率為69.03%±0.99%,Ea-花環(huán)的增長率為41.68%.

3 結(jié)論與討論

有關(guān)家兔的Et-玫瑰花環(huán)和Ea-玫瑰花環(huán)數(shù)據(jù)的報(bào)道極少,本試驗(yàn)檢測了家兔Et-玫瑰花環(huán)形成率為67.90%±2.45%,即家兔的正常T淋巴細(xì)胞數(shù)占淋巴細(xì)胞總數(shù)的67.90%,這個(gè)數(shù)據(jù)與人的T淋巴細(xì)胞總數(shù)（60%左右[12]）相近,與王婭所報(bào)道的數(shù)據(jù)13.5%±2.55%[3]存在很大差異.活性淋巴細(xì)胞數(shù)占淋巴細(xì)胞的48.72%±4.37%.T細(xì)胞總數(shù)和活性T細(xì)胞數(shù)可以反映機(jī)體的細(xì)胞免疫狀態(tài).

本次體外和體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明天一圓藍(lán)瘟毒康與兔淋巴細(xì)胞作用后,活性T淋巴細(xì)胞明顯增多.體外試驗(yàn)用藥后活性花環(huán)為61.66%±1.39%,明顯高于用藥前的48.72%±4.37%,提高率為26.55%,差異極顯著（P＜0.01）.體內(nèi)試驗(yàn)用藥后24 h其活性花環(huán)數(shù)高達(dá)69.03%±0.99%,較用藥前的48.72%±4.37%提高41.68%,差異極顯著（P＜0.01）.且比試驗(yàn)前T淋巴細(xì)胞總數(shù)67.90%±2.45%也略有升高.提示圓藍(lán)瘟毒康不僅可以激活T淋巴細(xì)胞,還可能誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖.

本試驗(yàn)表明中草藥制劑在提高動物機(jī)體免疫功能方面具有積極的意義,特別是在防治病毒性疾病上具有重要作用,而且無副作用,無殘留.

應(yīng)用E-玫瑰花環(huán)試驗(yàn)可以篩選具有免疫調(diào)節(jié)作用的中草藥,也可對中草藥制劑的作用進(jìn)行科學(xué)的檢驗(yàn)和考核.多數(shù)學(xué)者在做E-玫瑰花環(huán)試驗(yàn)時(shí),采用淋巴細(xì)胞分離層液分離淋巴細(xì)胞,費(fèi)工、費(fèi)時(shí)、成本高.本文采用紅細(xì)胞裂解液分離淋巴細(xì)胞,省工、省時(shí)、成本低廉,值得推廣.

[1]余傳霖.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)免疫學(xué)[M].上海：上海醫(yī)科大學(xué)出版社,1998：31-32.

[2]武建國.實(shí)用臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)[M].南京：江蘇科學(xué)技術(shù)出版社,1989：56-57.

[3]張忠杰,沈磊磊,虞耀土,等.黃芪多糖粉劑和注射劑對雛雞免疫功能和生產(chǎn)性能的影響試驗(yàn)[J].浙江畜牧獸醫(yī),2009（4）：6-7.

[4]王鳳霞,宮新城,劉占民,等.黃芪莖葉粉對雛雞生長性能及免疫功能的影響[J].中國飼料,2009（21）：11-13.

[5]李曉卉,殷中瓊.青刺果黃酮對雞紅細(xì)胞免疫及外周血淋巴細(xì)胞免疫功能的影響[J].中國獸醫(yī)雜志,2009,45（3）：43-44.

[6]歐陽素貞,王雙山,田素香,等.淫羊藿-蜂膠合劑促進(jìn)雞細(xì)胞免疫的研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2006,37（1）：80-83.

[7]呂信,朱東花,趙乃歡,等.中藥犢瀉康對犢牛免疫功能的影響[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,2009（2）：33-35.

[8]劉廷.中藥復(fù)方制劑連黃對動物細(xì)胞免疫水平及血清生化指標(biāo)的影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2008（3）：91-92.

[9]郭設(shè)平,王沂蒙,姜玉坤,等.雞胸腺肽的提取及其生物學(xué)活性的初步研究[J].中國家禽,2008,30（4）：12-15.

[10]王淑芳,王改利.中藥免疫增強(qiáng)劑在肉兔飼料中的應(yīng)用效果[J].中國養(yǎng)兔,2008（5）：4-6.

[11]范能全,曾繁榮.胸腺肽活性測定方法改進(jìn)[J].藥物研究,2004,13（10）：29-30.

[12]高曉明.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)基礎(chǔ)[M].北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社,2001：17-18.

（責(zé)任編輯：鄧天福）

Influence of Yuanlanwendukang on cellular immunity function of rabbit

Lu Yanyun1,Wang Fang2,Li Xue3,Li Xiaoliu4,Hu Houyong5,Hu Xueying1,Wang Xinhua2
（1.HuazhongAgricultural University,Wuhan 430070,China；2.Henan Institute ofScience and Technology,Xinxiang453003,China；3.Henan Heima Pharmaceutical Group Co.Ltd.,Zhengzhou 453003,China；4.The First Occupation High Sschool ofJiyuan City,Jiyuan 454691,China；5.The Chinese Peoples Liberation ArmyUnit 71697,Weihui 453100,China）

To study the effects of Yuanlanwendukang on cellular immunity function of rabbit,erythrocyte-rosette formation test was used in this experiment to test the normal rate of rabbit erythrocyte-rosette formation,erythrocyterosette formation rate,erythrocyte-rosette formationrate rate after drug effection in vitro and administrationin in vivo after 24 h.The result shows that the normal value of Et-rosette and Ea-rosette are 67.90%±2.45%and 48.725± 4.37%respectively,Ea-rosette formation rate of Yuanlanwendukang in vitro or vivo are 61.66%±1.395 and 69.035± 0.99%respectively.Its rise is obvious.The results showed that Yuanlanwendukang improves cellular immune function of animals significantly,providing theory basis for the drug’s clinical application.

Yuanlanwendukang,cellular immunity,E-rosette,Et-rosette,Ea-rosette

S829.1

A

1008-7516（2011）06-0049-04

10.3969/j.issn.1008-7516.2011.06.013

2011-06-25

逯艷云（1985-）,女,河南夏邑人,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士研究生.

王新華（1942-）,男,河南方城人,教授,主要從事家畜家禽的免疫研究.