李淑英,張 科,杜海軍,王 湛,慈雅麗,王新燕,周 玲,曾毅

2.中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所腫瘤病毒室,傳染病預防控制國家重點實驗室病毒性腫瘤組,北京 100052

BARF1是EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)編碼的Bam HIA區(qū)域的早期裂解基因,是近年來確認的EBV新的致癌基因,在EBV陽性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中可能起重要作用[1-3]。通過構(gòu)建攜帶BARF1基因的真核表達載體,轉(zhuǎn)染人胃上皮細胞,G418篩選后,獲得穩(wěn)定表達BARF1基因的人胃上皮細胞株,而探討B(tài)ARF1基因?qū)θ宋干掀ぜ毎鲋车挠绊憽?/p>

1 材料與方法

1.1 引物設計與合成 根據(jù)GenBank提供的BARF1基因序列,設計擴增目的基因BARF1的特異性引物,并在引物兩端添加酶切位點,引物序列見表1。

引物設計后,委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 攜帶BARF1基因真核表達載體的構(gòu)建與鑒定 提取B95-8細胞RNA(按試劑盒說明書操作)。RT-PCR擴增cDNA。以此cDNA為模板擴增目的基因BARF1,目的基因BARF1擴增產(chǎn)物與pUMT載體克隆反應(按試劑盒說明書操作)。堿裂解法提取質(zhì)粒;對所提質(zhì)粒進行PCR、酶切及測序鑒定(委托北京百泰克生物計劃有限公司測序)。

將上述質(zhì)粒進行雙酶切,并回收產(chǎn)物BARF1片段(按試劑盒說明書操作)。用EcoRI和XbaI進行雙酶切真核載體pcDNA3.1(+)-his,并進行回收。將回收BARF1片段與pcDNA3.1(+)-his片段按表2連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α,在含有氨芐青霉素的LB平板中篩選,用含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng),堿裂解法提取質(zhì)粒;對所提質(zhì)粒進行酶切鑒定。

表1 本研究中使用的擴增引物Table1 The primers used in this study

表2 真核載體 pcDNA3.1(+)-his與BARF1連接體系(20μ L)Table2 The vector pcDNA3.1(+)-his connected with the BARF1 gene(20μ L)

1.3 細胞培養(yǎng) 人胃上皮細胞GES-1培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)液中(添加10%滅活的小牛血清,100 u/mL青霉素和100 u/mL鏈霉素)。培養(yǎng)于37℃,5%CO2的溫箱中,每2～3d換液1次。

1.4 細胞的轉(zhuǎn)染、克隆及鑒定 用 lipofectamine2000介導,將pcDNA3.1(+)-his空載體及攜帶目的基因BARF1的真核表達載體轉(zhuǎn)染人胃上皮細胞GES-1(按試劑盒說明書操作)。用有限稀釋法進行克隆,轉(zhuǎn)染后第3d將細胞消化分散,按每孔200個細胞接入48孔細胞培養(yǎng)板,用含有300μ g/mL的G418培養(yǎng)液進行篩選,每 2-3d換1次液,長出抗性克隆后擴大培養(yǎng)。

將抗性克隆細胞擴大培養(yǎng)后,提取細胞RNA,RT-PCR鑒定BARF1基因的表達,所用引物如表1中BARF1#3與#4。

1.5 繪制細胞生長曲線檢測BARF1基因?qū)毎鲋车挠绊?/p>

1.5.1 細胞計數(shù)法繪制生長曲線 取生長狀態(tài)良好的細胞,采用一般傳代方法消化細胞,制成細胞懸液,使其濃度為1×103個細胞/mL。取24孔培養(yǎng)板,每孔接種濃度為1×103個細胞/mL 500μ L,每種細胞(未轉(zhuǎn)染細胞、轉(zhuǎn)染空載體細胞及轉(zhuǎn)染目的基因的細胞)分別接種4個復孔。每天取各孔細胞計數(shù),測出每孔中的細胞總數(shù),求出每組平均值,持續(xù)計數(shù)6d。將每天計數(shù)所得的細胞濃度標在對數(shù)坐標紙上,然后將各點連成曲線,即為生長曲線。

1.5.2 CCK-8法繪制生長曲線 取對數(shù)生長期的細胞,用0.25%胰蛋白酶(含有0.02%EDTA)消化單層培養(yǎng)細胞,用含10%血清的DMEM培養(yǎng)液配成單個細胞懸液,濃度為3×103個細胞/ml的細胞接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔加入200μ L,每種細胞設置4個復孔;空白對照孔只加DMEM培養(yǎng)基。將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中,37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。分別在細胞培養(yǎng)24h、48h和72h后,每孔加入CCK-8溶液10μ L(注意在孔中不要有氣泡生成),37℃,繼續(xù)孵育 3h,用酶標儀測定450nm處的吸光度,記錄結(jié)果。以培養(yǎng)時間為橫坐標,以吸光度為縱坐標,繪制出細胞增殖曲線。

1.6 統(tǒng)計學處理 以 Excel建立數(shù)據(jù)庫,應用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析,所有數(shù)值以均數(shù)±標準差(±s)表示;組間計數(shù)資料采用χ2檢驗,計量資料采用t檢驗,以P＜0.05為差異有顯著性,以P＜0.01為差異有極統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 BARF1基因真核表達載體的構(gòu)建與鑒定

2.1.1 細胞RNA提取 將所提RNA進行瓊脂糖凝膠電泳得到28S、18S和5S三條帶。圖1顯示B95-8是B95-8細胞提取的RNA,實驗提取 RNA完整,無明顯降解現(xiàn)象。

2.1.2 目的基因的擴增 以RT-PCR所得cDNA為模板擴增目的基因,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,得到大小約為666bp的片段,圖2,同預期結(jié)果一致。

2.1.3 BARF1基因的T-A克隆與鑒定 為了驗證目的基因是否已經(jīng)被成功連接到pUM-T原核載體上,我們對提取的質(zhì)粒進行了BARF1基因的擴增鑒定,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到大小為524bp的片段,與預期片段大小相一致,說明BARF1基因已克隆到pUM-T載體。

2.1.3.1 雙酶切鑒定 為了進一步證實BARF1基因已克隆到pUM-T載體,我們對提取的質(zhì)粒進行雙酶切,并對酶切產(chǎn)物進行電泳,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果,得到3個不同的片段,其大小分別為3.4kb(可能為未被切的質(zhì)粒)、2.7kb(與pUM-T載體大小相一致)及666bp(與插入的目的基因大小一致)。

2.1.3.2 測序鑒定 將所提質(zhì)粒測序后與Gen-Bank中的 B95-8細胞株的基因序列同源性為100%。

2.1.4 BARF1真核表達載體的構(gòu)建與鑒定BARF1與真核表達載體pcDNA3.1(+)-his連接、轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α,經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選后,對所提質(zhì)粒進行雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳得到5.4kb及666bp兩個片段,圖3。

圖3 真核質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.3 Identified eukaryotic plasmid by double enzyme digestion

2.2 轉(zhuǎn)染細胞鑒定BARF1基因的表達 G418為新霉素類似物,可以殺死沒有其抗性的細胞,而我們構(gòu)建的BARFl真核表達載體和空載體pcDNA(3.1)-his均具有neo抗性,所以通過G418可以篩選出陽性克隆細胞。約2w后即可看到有G418抗性克隆出現(xiàn),而沒有成功轉(zhuǎn)染的細胞均已死亡。每種轉(zhuǎn)染細胞分別挑出3個單克隆擴大培養(yǎng)。

從陽性克隆細胞(包括BARFl轉(zhuǎn)染的細胞和空載體轉(zhuǎn)染的細胞)及未轉(zhuǎn)染細胞 GES-1中提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄,以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板 PCR擴增BARF1。擴增BARFl用表1中引物3與4,擴增長度為524 bp,圖4,Neg是以無菌雙蒸水為模板的陰性對照,B95-8是以B95-8細胞的cDNA為模板的陽性對照,1是GES-1細胞cDNA為模板的擴增,2是轉(zhuǎn)染空載體細胞cDNA模板的擴增,3,4,5分別代表轉(zhuǎn)染BARF1基因細胞的cDNA模板的擴增。

圖4 轉(zhuǎn)染細胞鑒定BARF1基因的表達Fig.4 Identified BARF1 gene for transfected cells

2.3 轉(zhuǎn)染細胞生長曲線的繪制

2.3.1 細胞計數(shù)法 將轉(zhuǎn)染了BARF1基因組細胞、對照組正常GES-1細胞和空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染GES-1細胞接種于24孔板,各組細胞同步化,使細胞處于同一個生長狀況后,分別以培養(yǎng)1,2,3,4,5,6d的4個重復孔細胞數(shù)的均數(shù)作圖,繪制生長曲線,可見:培養(yǎng)3d后,轉(zhuǎn)染了BARF1基因組的細胞數(shù)量及TPA刺激的轉(zhuǎn)染了BARF1基因組細胞數(shù)量,開始超過了對照組正常GES-1細胞和空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染GES-1細胞的數(shù)量,隨著培養(yǎng)時間的增加,這一差異越來越大。提示:轉(zhuǎn)染了BARF1基因的GES-1細胞及其TPA刺激組細胞生長速度比對照組正常GES-1細胞和空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染GES-1細胞加快,圖5。

2.3.2 CCK-8法 將轉(zhuǎn)染了 BARF1基因及其TPA刺激組細胞和對照組正常GES-1細胞和空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染GES-1細胞接種于96孔板,各組細胞同步化,使細胞處于同一個生長狀況后,分別以培養(yǎng)24h,48h,72h后的4個重復孔先后加入CCK-8后的OD值的均數(shù)作圖,繪制生長曲線,可見:各組細胞先后加入CCK-8后的OD值在細胞培養(yǎng)了1d后,轉(zhuǎn)染了BARF1基因及其TPA刺激組的OD值開始超過了對照組正常GES-1細胞和空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染GES-1細胞的OD值,隨著培養(yǎng)時間的增加,這一差異越來越大。提示:轉(zhuǎn)染了BARF1基因及其TPA刺激組細胞生長速度比對照組正常GES-1細胞和空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染GES-1細胞快,表3。

圖5 細胞計數(shù)法繪制各組細胞生長曲線Fig.5 The growth curve of different groups of cells detected by the method of cell counting

表3 通過CCK-8法計算不同培養(yǎng)時間細胞的數(shù)量(±s)Table 3 The quatitiesof different group cellsat different time by the method of CCK-8

表3 通過CCK-8法計算不同培養(yǎng)時間細胞的數(shù)量(±s)Table 3 The quatitiesof different group cellsat different time by the method of CCK-8

Note:Compared with the control groups,*P＜0.05,Compared TPAGES-1/BARF1 with GES-1/BARF1 group,△P＜0.05

組別 24 h 48 h 72 h GES-1 0.86±0.28 1.12±0.30 1.28±0.33 GES-1/P cDNA3 0.92±0.36 1.18±0.41 1.23±0.41 GES-1/BARF1 1.48±0.21* 1.76±0.28 1.89±0.29*TPA-GES-1/BARF1 1.59±0.45*△ 1.88±0.29*△ 1.98±0.42*△

3 討 論

EB病毒是一種致瘤病毒,該病毒DNA以線性雙鏈的構(gòu)型存在,基因組大小為172kb。BARF1是近年來確認的EBV新的致癌基因,其致癌作用日益受到關(guān)注。李友瓊等[4]將BARF1基因轉(zhuǎn)染胃癌細胞系SGC7910后,能夠全面增強胃癌細胞的腫瘤原性。

由于目前BARF1基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中的確切作用尚不清楚,并且在體內(nèi)研究某一單個基因較為困難,我們通過構(gòu)建攜帶BARF1基因的真核表達載體pcDNA3.1(+)-his/BARF1,建立了穩(wěn)定表達BARF1基因的人胃上皮細胞株,從而建立了BARF1基因致瘤的體外模型,可進一步研究BARF1基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中確切作用。

本次研究采用的脂質(zhì)體介導法轉(zhuǎn)染細胞,該方法具有較多優(yōu)點:操作簡便,轉(zhuǎn)染效率比較高,對細胞類型運用范圍廣,對轉(zhuǎn)染的核酸類型和分子量有很高的包容性,細胞毒性小。其原理是陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷,能與核酸的磷酸根通過靜電作用,將DNA分子包裹入內(nèi),形成DNA-脂復合體,也能被表面帶負電荷的細胞膜吸附,再通過融合或細胞內(nèi)吞作用進入溶酶體。內(nèi)吞后的DNA-脂復合體在細胞內(nèi)形成的包涵體,在輔助脂質(zhì)體二油酰磷脂已醇胺(DOPE)作用下,細胞膜上的陰離子脂質(zhì)因膜的不穩(wěn)定而失去原有的平衡擴散進入復合體,與陽離子脂質(zhì)中的陽離子形成中性離子對,使原來與脂質(zhì)體結(jié)合的DNA游離出來,進入細胞質(zhì),進而通過核孔進入細胞核,最終進行轉(zhuǎn)錄并表達。

G418是一種氨基糖類抗生素,其結(jié)構(gòu)與新霉素、慶大霉素、卡那霉素相似,它通過影響80S核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成,是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最常用的選擇試劑。當neo基因被整合進真核細胞基因組合適的地方后,則能啟動 neo基因編碼的序列轉(zhuǎn)錄為mRNA,從而獲得抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的高效表達,使細胞獲得抗性而能在含有G418的選擇性培養(yǎng)基中生長。

通過繪制細胞生長曲線發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染了BARF1基因及其TPA刺激組的細胞,經(jīng)過一定時間培養(yǎng)后,超過了對照組正常GES-1細胞和空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染GES-1細胞的增殖速度,隨著培養(yǎng)時間的增加,這一差異越來越大,3d后這一差異明顯,提示:轉(zhuǎn)染了BARF1基因及其TPA刺激組細胞生長速度比對照組正常GES-1細胞和空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染GES-1細胞加快,可能是BARF1基因可以促進細胞增殖的原因。

[1]Seto E,Yang L,Middeldorp J,et al.Epstein Barr virus(EBV)encoded BARF1 gene is ex pressed in nasophary ngeal carcinoma and EBV-associated gastric carcinoma tissues in the absence of lytic gene expression[J].J Med Virol,2005,76(1):82-88.

[2]Fio rini S,Ooka T.Secretion of Epstein Barr virus-encoded BARF1 oncoprotein from latently infected B cells[J].Virol J,2008,5(70):1186-1743.

[3]宋立兵,李雋,曾木圣,等.EB病毒編碼的BARF1基因在人支氣管上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤形成中的作用[J].癌癥,2004,23(11):1361-1364.

[4]李友瓊,張雪怡,曾健,等.EB病毒BARF1基因表達對胃癌細胞株SGC7910生物學行為的影響[J].江蘇大學學報(醫(yī)學版),2009,19(3):214-219.