張奕強(qiáng),劉文倩,劉永生,王 印,姚學(xué)萍,張 杰

2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,動物檢疫實驗室,雅安625014

豬鏈球菌(Streptococcus suis)屬球菌科(Coccaceae),鏈球菌屬(Streptococcus),為革蘭氏陽性兼性厭氧菌。根據(jù)莢膜多糖抗原差異,可將其分為35個血清型,分別為1/2型及1～34型。該菌感染宿主范圍寬,致病性強(qiáng),豬感染后可發(fā)生淋巴結(jié)膿腫、肺炎、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎以及敗血癥等癥狀,并且人通過特定的傳播途徑亦可感染該菌[1-2]。國外自1968年丹麥?zhǔn)状螆蟮懒素i鏈球菌導(dǎo)致人嚴(yán)重感染病例后,已有數(shù)十個國家報道了此類病例,在1968-1989年間,全球共報道人感染Ⅱ型鏈球菌病例108例[3-4]。1998年江蘇發(fā)生豬鏈球菌小范圍爆發(fā)[5],2005年6-8月四川省發(fā)生了人-豬鏈球菌病疫情,導(dǎo)致204人感染,38人死亡,引起了國內(nèi)外的重視[6]。仔豬感染豬鏈球菌后的病死率達(dá) 10%～25%,育肥豬的發(fā)病率為 2%～20%,死亡率逐年升高,嚴(yán)重威脅全國的生豬養(yǎng)殖業(yè),造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于臨床上常見豬鏈球菌與豬瘟、豬偽狂犬病、豬肺疫、藍(lán)耳病等混合感染或繼發(fā)感染,這不僅使病情復(fù)雜化,而且增大了病死率和防治的難度[7],所以建立良好的動物感染模型,對研究豬鏈球菌感染的致病機(jī)理,以及其與宿主之間的相互作用有極其重要的意義,對開發(fā)防治豬鏈球菌感染的藥物和疫苗有積極作用。本文旨在觀察豬鏈球菌感染BALB/c小鼠后的各種臨床癥狀,各器官大體病變,并通過病理切片從組織學(xué)水平觀察、分析各器官病變,為將BALB/c小鼠作為實驗室研究豬鏈球菌的實驗動物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株 SS-sic05株由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物檢疫實驗室于2005年分離自四川某豬場一病死仔豬淋巴結(jié)。

1.2 實驗動物 選取8周齡,體重 16～20g,體況良好的BALB/c小鼠14只,雌雄各半,由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供。

1.3 實驗動物的感染 將菌種接種10%血瓊脂平板(按文獻(xiàn)8所述方法配制)在有氧條件下置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后,用適量PBS洗下菌落。菌液按麥?zhǔn)媳葷岱ù_定濃度,然后將其稀釋到約1×109CFU/mL,經(jīng)腹腔注射感染10只小鼠,雌雄各半,每只注射0.2mL,另取4只注射等量PBS作為對照。每日觀察感染后小鼠的各種行為及癥狀并做記錄。

1.4 病死小鼠的解剖及病理切片制作 無菌選取病變組織或器官接種10%血瓊脂平板作病原的分離鑒定,并將選取的病變組織或器官浸泡于10%中性福爾馬林中固定。將經(jīng)固定的樣品做常規(guī)脫水,石蠟包埋,連續(xù)切片,切片厚度5μ m,HE染色后觀察、拍照。

1.5 病原的分離 將1.2.2中所述血瓊脂平板置于37℃溫箱培養(yǎng)24～48h,挑取平板上單個菌落作革蘭氏染色,觀察其形態(tài)和染色特性,根據(jù)鏡檢結(jié)果挑取疑似鏈球菌的單個菌落作純化培養(yǎng),分別接種于血瓊脂平板和血清肉湯(按文獻(xiàn)8所述方法配制)。

1.6 PCR鑒定 用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(購自 TianGen公司)提取純化后的疑似菌株的DNA,選用能擴(kuò)增大多數(shù)細(xì)菌的近乎全長的 16s RNA基因的通用引物對27F/1522R[9](由上海生工生物工程有限公司合成,序列見表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒(購自AXYGEN公司)回收后連接pMD-18T載體(購自大連寶生物工程有限公司),轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞(購自TianGen公司),經(jīng)菌落PCR和質(zhì)粒載體雙酶切鑒定后,挑選陽性克隆送上海桑尼生物科技有限公司測序。測序結(jié)果在GenBank上進(jìn)行Blast比對。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min;然后94℃變性1min,55℃退火1min,72℃延伸1.5min,循環(huán)35次;最后72℃延伸10min。

表1 用于擴(kuò)增豬鏈球菌16s RNA基因的通用引物T able 1 Primers for amplification of 16s RNA fragment from Streptococcussuis

1.7 生化試驗 將血清肉湯中的菌液以無菌操作分別對葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、尿素、七葉苷、水楊素生化發(fā)酵管(購自杭州微生物試劑有限公司)作穿刺接種。接種后,置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h后觀察結(jié)果。結(jié)果判斷依據(jù)參照文獻(xiàn)10。

1.8 藥敏試驗 用先鋒霉素Ⅴ、先鋒霉素Ⅵ、頭孢呋肟、氯霉素、紅霉素、新霉素、四環(huán)素、青霉素、氨芐青霉素、羧芐青霉素、苯唑青霉素和氧哌嗪青霉素等12種常用抗菌藥物的藥敏紙片(購自杭州微生物試劑有限公司)對分離菌進(jìn)行抑菌試驗。將分離菌用接種環(huán)致密劃線于鮮血瓊脂平板,用無菌鑷子將以上抗菌藥物的藥敏紙片分別貼于培養(yǎng)基表面,各片距離要相等,37℃培養(yǎng)24h后觀察測量抑菌圈的直徑并記錄結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)以抑菌圈直徑小于10mm為耐藥,直徑在10～15mm為中度敏感,直徑大于15mm以上為高度敏感[11]。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠致病性 感染3d后對照組小鼠均健康存活;實驗組小鼠感染9h后開始出現(xiàn)精神萎靡,隨后先后出現(xiàn)扎堆、顫抖、厭食、四肢癱瘓等癥狀。第一只小鼠死亡時間是感染22h后,感染68h后最后1只小鼠死亡。死后解剖可見皮下出血,血液凝固不良;打開腹腔可見腸道有多量漿液性滲出,小腸腸壁變薄并充滿黃色液狀內(nèi)容物,見圖1。肝臟明顯淤血或出血,質(zhì)地易碎,見圖2。脾臟腫大,邊緣鈍圓,有明顯出血或淤血,見圖3。腎臟一定程度腫脹,有淤血或出血;打開胸腔可見肺部有明顯的出血或淤血,嚴(yán)重者可在其表面見灰白色壞死灶或發(fā)生肺肉變,見圖4。

圖1 小腸腸炎Fig.1 Enteritis

2.2 組織病理變化 小鼠肺部出現(xiàn)以充血、出血以及炎性細(xì)胞大量炎性細(xì)胞浸潤為主的病理變化,見圖5。肝臟中央靜脈以及肝血竇明顯淤血,肝細(xì)胞顆粒變性,后期發(fā)生凝固性壞死,并伴有大量嗜中性粒細(xì)胞的浸潤,見圖6。脾臟大量炎性細(xì)胞增生,包括多核巨細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞增生,見圖7。腎臟的腎小球毛細(xì)血管出血,腎間質(zhì)出血,腎小管上皮細(xì)胞胞核固縮、溶解,細(xì)胞腫脹、破裂,腎小管結(jié)構(gòu)崩解,見圖8。

2.3 分離細(xì)菌的形態(tài)特征及培養(yǎng)特性 37℃恒溫培養(yǎng)24h后,在血瓊脂培養(yǎng)基上形成表面光滑、透明、圓形、濕潤、邊緣整齊、針尖大小的露滴樣的無色小菌落,直徑約1mm。并且在菌落周圍形成明顯的β溶血環(huán),直徑3～5mm。在血清肉湯試管底部形成絮狀沉淀,上部澄清。顯微鏡檢查均為革蘭氏陽性球菌,鮮血瓊脂平板培養(yǎng)物中多呈2～5個短鏈狀排列,血清肉湯培養(yǎng)物呈長鏈狀排列。

2.4 生化試驗 生化糖發(fā)酵管的結(jié)果與豬鏈球菌的生化特性相符,見表2,說明該分離菌株為豬鏈球菌。

表2 生化試驗結(jié)果T able 2 Result of biochemistry properties test

2.5 16s RNA鑒定 經(jīng)過PCR擴(kuò)增出現(xiàn)了一條約1500bp的條帶,與預(yù)期片段大小相當(dāng),見圖9。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后,連接pMD-18T載體,經(jīng)菌落PCR和質(zhì)粒載體雙酶切鑒定后(圖10),挑選陽性克隆送測序。將所得測序結(jié)果進(jìn)行Blast比對,其16s RNA與Streptococcussuis P1/7(AM946016.1),Streptococcus suis SC84(FM252031.1)以及 Streptococcus suis BM407(FM252032.1)等菌株的16s RNA同源性達(dá)99%,僅有幾個堿基差別,再次證明該菌株為豬鏈球菌。

2.6 藥敏試驗 12種藥物所形成的抑菌圈的直徑見如表3。從不同藥物產(chǎn)生的抑菌圈的直徑可以看出:所用的12種藥物對豬鏈球菌均有不同程度的抑菌作用。該菌株對先鋒霉素Ⅴ、先鋒霉素Ⅵ、頭孢呋肟、氯霉素、紅霉素、青霉素、氨芐青霉素、羧芐青霉素、苯唑青霉素和氧哌嗪青霉素高度敏感,而對新霉素中度敏感,對四環(huán)素耐藥。

表3 藥敏試驗結(jié)果Table 3 Sensitivity to antibiotics

3 討 論

隨著集約化養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展,豬鏈球菌感染及流行嚴(yán)重威脅著世界各國的生豬養(yǎng)殖業(yè),導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2005年四川所暴發(fā)的人-豬鏈球菌病疫情更是引起了社會的廣泛關(guān)注。因而建立合適的動物模型,對于展開豬鏈球菌的致病機(jī)理及免疫機(jī)制等的深入研究就顯得尤為重要。小鼠因其具有遺傳背景清楚,個體差異小,飼養(yǎng)管理方便,費用相對低廉以及實驗技術(shù)相對成熟等優(yōu)點,所以成為大多數(shù)研究者優(yōu)先考慮的實驗動物。Daminguez-Punaro等[12]在以豬鏈球菌血源性感染CD1小鼠成功建立感染模型的基礎(chǔ)上,又進(jìn)一步建立了C57BL/6和A/J小鼠模型,并進(jìn)行了對比試驗,發(fā)現(xiàn)兩種小鼠對豬鏈球菌都敏感,A/J小鼠在早期感染中更為敏感,說明小鼠可以作為豬鏈球菌感染的動物模型。

本研究中,通過分離細(xì)菌的形態(tài)觀察、培養(yǎng)特性、生化試驗和PCR鑒定結(jié)果,表明小鼠確由感染豬鏈球菌致死,體內(nèi)各組織器官病變均由感染豬鏈球菌而引起。通過解剖和組織學(xué)觀察,發(fā)現(xiàn)小鼠全身皮膚、漿膜、粘膜及各主要器官發(fā)生不同程度的出血與淤血,即在BALB/c小鼠上成功模擬出典型的敗血癥病變,說明BALB/c小鼠能夠作為良好的實驗室研究豬鏈球菌的感染動物。值得一提的是,小鼠感染豬鏈球菌后,在各主要器官發(fā)生大量嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及單核巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤時,脾臟的淋巴細(xì)胞卻在減少。這可能是由于在發(fā)生急性脾炎時,脾臟的淋巴細(xì)胞、網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生彌漫性或局灶性的壞死、崩解,致使脾臟固有的組織細(xì)胞成分明顯減少,增生的嗜中性粒細(xì)胞與單核巨噬細(xì)胞除了要清除病原菌外,還要吞噬、清除壞死區(qū)崩解、破碎后的細(xì)胞成分,所以在顯微鏡下觀察脾臟的實質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化。

根據(jù)藥敏試驗的結(jié)果可以知道,通常的抗革蘭氏陽性菌的藥物對該株豬鏈球菌均有一定的作用,但是四環(huán)素與氨基糖苷類的新霉素效果不佳,可能是由于該株豬鏈球菌對四環(huán)素與新霉素產(chǎn)生了耐藥性。紅霉素、氯霉素、青霉素類、頭孢菌素類藥物的效果十分良好,可以用于臨床上對患病動物的治療。但是,由于各地各個豬場豬鏈球菌的流行情況與平常用藥的情況不盡相同,所以此藥敏試驗的結(jié)果僅供參考。再次,在治療時應(yīng)根據(jù)患病動物的癥狀,正確的選擇特異有效的抗生素,注意用藥劑量和療程,不能濫用抗生素。

目前為止,雖然已有許多有關(guān)豬鏈球菌動物感染模型的報道,各類動物模型各有特點,但是對于動物模型的選擇還是沒有定論。所以,還要不斷地對豬鏈球菌的動物感染模型進(jìn)行研究,改良出能更真實地反映豬鏈球菌感染后各種病理生理變化過程的動物模型,更好地開發(fā)出防治豬鏈球菌的藥物和疫苗,來更有效地防控豬鏈球菌病的危害。

[1]Gottschalk M,Xu J,Calzas C,et al.Streptococcus suis:a new emerging or an old neglected zoonotic pathogen[J].Future Microbiol,2010,5(3):371-391.

[2]Baums CG,Verkuhlen GJ,Rehm T,et al.Prevalence of Streptococcus suis genotypes in wild boars of Northwestern Germany[J].Appl Environ Microbiol,2007,73(3):711-717.

[3]Dupas D,Vignon M.Streptococcus suis meningitis:A sever noncompensated occupational disease[J].Occup Med,1992,34:1102-1105.

[4]Wertheim HF,Nghia HD,Taylor W,et al.Streptococcussuis:an emerging human pathogen[J].Clin Infect Dis,2009,48(5):617-625.

[5]朱善冰,林上統(tǒng).浙江省蒼南縣首例人感染豬鏈球菌病流行病學(xué)調(diào)查[J].上海預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2008,20(12):577-578.

[6]熊忠良,徐滌平.我國重大動物疫病流行現(xiàn)狀及其防控策略[J].湖北畜牧獸醫(yī),2007,12:22-24.

[7]萬遂如.人獸共患病的現(xiàn)狀與防制(十)豬鏈球菌2型流行與公共衛(wèi)生安全[J].動物保健,2005,8:22-23.

[8]姚火春.獸醫(yī)微生物學(xué)實習(xí)指導(dǎo)[M].2版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2002:20-21.

[9]Giovannoni SJ.(1991)T he poly merase chain reaction.In:Sequencing and Hybridization Techniques in Bacterial Systematics.Stackebrandt E,and Goodfellow M.(eds).New Yo rk:John Wiley&Sons,pp:177-201.

[10]陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].3版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2001:204-212.

[11]王雙山,張敬禮,袁逢新.豬鏈球菌的分離鑒定[J].中國畜牧獸醫(yī),2007,34(1):108-109.

[12]Dominguez-Punaro ML,Segura M,Radzioch D,et al.Comparison of the susceptibilities of C57BL/6 and A/J mouse strains to Streptococcus suis serotype 2 infection[J].Infect Immun,2008,76(9):3901-3910.