司麗芳，陳樹林，范光麗，高春生，趙 瑾

（1.河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，河南洛陽471003；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌712100；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州450002；4.上海朝翔生物技術(shù)有限公司，上海201609）

胚胎在母體子宮的生長發(fā)育是動物個體發(fā)育的重要階段，期間多種生長因子和激素均起著調(diào)控作用［1］，IFN-γ屬于免疫 調(diào)控型 細(xì)胞因子［2-3］，在免疫性疾病的治療中用途廣泛［4-6］，也是妊娠調(diào)控中必需的細(xì)胞因子之一［7］。研究表明，IFN-γ在卵泡發(fā)育、胚胎植入、妊娠維持等方面均發(fā)揮一定功能，主要通過參與妊娠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化及影響有機(jī)體性器官激素水平而在妊娠維持中發(fā)揮其調(diào)控［8-9］。有研究證明，給孕鼠注射低劑量的IFN-γ不僅對妊娠維持起著一定的作用，而且還有利于增強(qiáng)孕鼠抗寄生蟲感染的能力［10］。卵巢屬于重要的生殖器官，其功能活動受到垂體和下丘腦的調(diào)控。腺垂體內(nèi)促性腺激素細(xì)胞分泌的FSH 和LH，隨著血流到達(dá)卵巢時，與分布在卵泡顆粒細(xì)胞上特異性FSH和LH 受體結(jié)合，從而可以促進(jìn)卵泡的生長及卵泡類固醇的生成［11-12］。近年來對于卵巢中細(xì)胞因子表達(dá)變化的研究較多，但有關(guān)IFN-γ在卵巢中的分布和表達(dá)情況的報道較少，對其在胚泡植入期卵巢中的定位和表達(dá)尚未見報道。為此，本研究采用免疫組織化學(xué)和圖像分析方法，對大鼠胚泡植入期卵巢中IFN-γ的表達(dá)進(jìn)行了研究，以探討IFN-γ在早期胚胎發(fā)育和胚泡植入過程中的調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步闡明IFN-γ及其相關(guān)因子對妊娠的調(diào)控提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

健康性成熟SD 大鼠，體重200g～220g，購自河南省實驗動物中心，飼養(yǎng)管理1 周后用于試驗。用陰道涂片法檢測發(fā)情周期，取發(fā)情期的雄鼠與雌鼠1∶1 合籠過夜。次日清晨逐個檢查雌鼠，發(fā)現(xiàn)精子或陰道栓者定為妊娠D1。取妊娠D6大鼠10只進(jìn)行試驗。

1.2 方法

1.2.1 取材及切片 實驗動物均在上午9 時處死取卵巢，隨后迅速置于4℃40mL／L 的多聚甲醛磷酸緩沖液中固定12h～24h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，做連續(xù)切片，片厚5μm，隔3取3，共制備3套切片，一套行HE染色以作陽性細(xì)胞定位，一套用于陰性對照，一套用于IFN-γ免疫組化染色。

1.2.2 免疫組化操作程序 一抗為兔抗鼠的IFN-γ多克隆抗體（工作濃度1∶100，武漢博士德公司生產(chǎn)），陰性對照采用0.01mol／L PBS 緩沖液代替一抗，按如下程序進(jìn)行①切片脫蠟復(fù)水，經(jīng)pH 6.0的0.01mol／L 的檸檬酸抗原修復(fù)液熱抗原修復(fù)。②每張切片加1 滴（約50μL）過氧化酶阻斷溶液（A液），室溫下孵育10 min，PBS 沖洗3 次，每次3min。③除去PBS液，每張切片加1 滴（約50μL）正常非免疫動物血清（B 液），室溫下孵育10min。④除去血清，每張切片加1滴（約50μL）兔抗大鼠IFN-γ抗體，室溫下孵育60 min 或4℃過夜。⑤PBS沖洗3次，每次5min。除去PBS 液，每張切片加1 滴（約50μL）生物素標(biāo)記的第二抗體（C液），室溫下孵育10 min。PBS 沖洗3 次，每次3 min。⑥除去PBS液，每張切片加1 滴（約50μL）鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液（D 液），室溫下孵育10min。PBS沖洗3 次，每次3min。⑦除去PBS 液，每張切片加2 滴（約100μL）新鮮配置的DAB 溶液，顯微鏡下觀察3min～10min。⑧自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，自來水沖洗返藍(lán)。⑨梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對照組切片染色按免疫組織化學(xué)超敏SP法染色步驟進(jìn)行，只是把步驟④中加的兔抗大鼠IFN-γ 抗體用PBS液代替，其余步驟完全相同。

1.2.3 結(jié)果判斷 染好的切片均在顯微鏡下觀察并照相。光鏡視野下，有棕色顆粒的細(xì)胞判為陽性，根據(jù)著色強(qiáng)弱可分以下幾級：淡棕色判斷為弱陽性；棕色判斷為中等陽性；深棕色判斷為強(qiáng)陽性。陰性對照切片無色或淡黃色。

2 結(jié)果

免疫反應(yīng)產(chǎn)物在不同發(fā)育階段的卵泡及卵泡液和粒性黃體細(xì)胞均廣泛分布。在原始卵泡的卵母細(xì)胞及其周圍一層扁平的卵泡細(xì)胞的胞漿內(nèi)均充滿棕色顆粒，呈現(xiàn)強(qiáng)陽性反應(yīng)。在初級卵泡的顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞及其卵泡膜細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)也充滿棕色陽性顆粒，呈現(xiàn)強(qiáng)陽性反應(yīng)。次級卵泡的顆粒細(xì)胞及其卵泡內(nèi)膜細(xì)胞的胞漿中IFN-γ蛋白也呈現(xiàn)強(qiáng)陽性反應(yīng)，而卵母細(xì)胞則呈現(xiàn)弱陽性反應(yīng)（圖1A）。在近成熟卵泡的卵泡液與卵母細(xì)胞呈現(xiàn)中等陽性反應(yīng)，顆粒細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)陽性反應(yīng)，陽性產(chǎn)物定位于細(xì)胞漿中卵泡內(nèi)膜細(xì)胞則呈弱陽性反應(yīng)，陽性產(chǎn)物定位于胞漿中?；|(zhì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)陽性反應(yīng)，卵巢表面被覆的單層立方形的生殖上皮細(xì)胞也呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，黃體中的粒性黃體細(xì)胞的胞漿呈現(xiàn)強(qiáng)陽性反應(yīng)（圖1B）。

圖1 胚泡植入期SD 大鼠卵巢組織中IFN-γ 蛋白分布圖（400×）Fig.1 Photographs o f IFN-γstaining location during implantation of embryo in SD rat ovary

3 討論

胚胎的植入是一個復(fù)雜的生理過程，需要諸多激素、細(xì)胞因子、生長因子及其與基質(zhì)降解相關(guān)的酶分子和血管形成因子等的共同參與。近年的研究表明，IFN-γ對妊娠有重要影響［13-14］，是妊娠必須的細(xì)胞因子之一。在正常妊娠狀態(tài)下，適量IFN-γ可以防止胎盤組織過度生長而侵入子宮。IFN-γ在保持蛻膜細(xì)胞的完整性、蛻膜血管的重建以及"著床窗口"的打開方面也起著重要作用［15］，有研究報道在胚胎植入點的許多細(xì)胞均表達(dá)IFN-γ受體。Hirota Y 等［16］研究報道，在胚胎植入期間，滋養(yǎng)層細(xì)胞和胚胎分泌的IFN-γ均可以促進(jìn)胚胎的附植及正常妊娠的維持，這種有益作用是通過IFN-γ刺激子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞表達(dá)CXCL11（一種化學(xué)趨化因子）而實現(xiàn)的，CXCL11能夠誘導(dǎo)T 細(xì)胞以及滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移，還可以誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖及子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的凋亡，而關(guān)于IFN-γ在胚胎植入期卵巢組織中表達(dá)的研究尚未見報道。

宿濱等［17］研究報道，離體培養(yǎng)的兔卵巢顆粒細(xì)胞中能觀察到IFN-γ對顆粒細(xì)胞產(chǎn)生的孕酮具有促進(jìn)作用。Grasso G 等［18］也研究證實，人卵泡液中IFN-γ的濃度明顯高于外周血中的濃度而對妊娠起著重要作用。易小芳［19］通過ELISA 法檢測正常妊娠人類卵泡液中IFN-γ對妊娠卵巢的分泌功能有影響。本研究結(jié)果表明，IFN-γ在植入期大鼠卵巢的各級卵泡、卵泡液及黃體的粒性黃體細(xì)胞均有分布，表明IFN-γ在大鼠妊娠植入期發(fā)揮著一定調(diào)節(jié)作用，有關(guān)其作用機(jī)理尚待深入研究。

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