臧彩紅，張 艷，江金花，王 寧，韓 立，馬 方，王慶端

(1.河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院，2.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，3.河南省肝病藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種高發(fā)性腫瘤，其發(fā)病率在全世界位列第五，而在腫瘤導(dǎo)致的死亡中位列第三［1］。在北美和西歐一些國(guó)家中，每100 000人中大約有10人會(huì)因?yàn)榛加懈伟┒鴮?dǎo)致死亡，而在亞洲和非洲一些國(guó)家中，每100 000人中會(huì)有50～150因此而死亡［2］。盡管在過去的50年中，對(duì)肝癌的治療大有改進(jìn)，但肝癌細(xì)胞容易對(duì)一些化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)而導(dǎo)致治療效果一直不佳［3］。MDR是指腫瘤細(xì)胞對(duì)一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性的同時(shí)對(duì)其他結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的抗腫瘤藥物也產(chǎn)生交叉耐藥性［4－5］。其中產(chǎn)生多藥耐藥的一個(gè)很重要原因是P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的過度表達(dá)。P-gp是膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)超家族成員之一，定位于細(xì)胞膜。Kimura等［6］發(fā)現(xiàn)在真核生物中 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子(ATP-binding cassette transporter)具有運(yùn)輸調(diào)節(jié)通道功能，而P-gp是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子超家族中最主要的成員，P-gp主要通過ATP的水解而實(shí)現(xiàn)其運(yùn)輸功能。近年來，也有學(xué)者通過影響ATP來研究活性氧對(duì) P-gp 的調(diào)節(jié)作用［7－8］。

為克服MDR需尋找有效的逆轉(zhuǎn)劑，目前研究證實(shí)多數(shù)逆轉(zhuǎn)劑如維拉帕米和環(huán)孢素A應(yīng)用于體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生很大的毒性而限制其臨床應(yīng)用。鹽酸千金藤堿(cepharanthine hydrochloride，CH)是從防已科千金藤屬植物的塊莖中提取分離出來的一種雙芐基異喹啉類生物堿千金藤堿［9］與鹽酸成鹽而得。近年來，國(guó)外文獻(xiàn)表明其具有逆轉(zhuǎn)多柔比星等一些抗腫瘤藥物產(chǎn)生的耐藥性［10］，也有文獻(xiàn)報(bào)道在體外通過影響P-gp ATP酶活性逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性［11］，但對(duì)于逆轉(zhuǎn)肝癌多藥耐藥的體內(nèi)研究，尤其通過影響P-gp ATP酶活性的體內(nèi)研究比較少見。在臨床上，有觀察發(fā)現(xiàn)，肝癌患者更易對(duì)多柔比星(adriamycin，ADR)、順鉑(cis-dichlorodiamineplatinum，CDDP)、5-氟尿嘧啶(5-flurouracil，5-FU)產(chǎn)生耐藥，本課題在模擬臨床FAP(ADR+CDDP+5-FU)方案，由本實(shí)驗(yàn)室成功建立BALB/c小鼠肝癌多藥耐藥的模型基礎(chǔ)上，研究CH聯(lián)合FAP對(duì)P-gp ATP酶活性的影響，從而進(jìn)一步探討CH聯(lián)合FAP對(duì)肝癌多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株與動(dòng)物H22肝癌細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存，H22/FAP肝癌多藥耐藥細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室模擬臨床FAP方案，采用藥物ADR、CDDP、5-FU濃度梯度遞增誘導(dǎo)法誘導(dǎo)而成［12］。

清潔級(jí)BALB/c小鼠，♀，6～8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)自河南省動(dòng)物中心(許可證號(hào):SCXK(豫)2005-0001)，IVC獨(dú)立供風(fēng)系統(tǒng)內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)。

1.1.2藥品與試劑鹽酸千金藤堿注射液，批號(hào)20081104，規(guī)格5 g·L－1，由河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院提供;鹽酸多柔比星注射液，規(guī)格10 mg/支，批號(hào)091201，購(gòu)自浙江海正藥業(yè)股份有限公司;順鉑注射液，規(guī)格10 ml∶10 mg，批號(hào)091205，購(gòu)自云南生物谷燈盞花藥業(yè)有限公司;氟尿嘧啶注射液，規(guī)格10 ml∶0.25 g，批號(hào)091201，購(gòu)自上海旭東海普藥業(yè)有限公司;維拉帕米注射液，規(guī)格2 ml∶5 mg，批號(hào)090901，購(gòu)自上海禾豐制藥有限公司;依他酸，批號(hào)058K5426，規(guī)格10 g;毒毛花苷，批號(hào)029K1076，規(guī)格 250 mg;MgATP，批號(hào) 048K5154，規(guī)格 100 mg，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;二硫蘇糖醇，批號(hào)233155，規(guī)格1 g，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;其他試劑均為市售分析純級(jí)。

1.2 方法

1.2.1MTT法檢測(cè)CH、VER對(duì)H22/FAP的最大無毒劑量抽取小鼠H22/FAP腹水瘤細(xì)胞，PBS洗2次，采用Ficoll-Hypaque不連續(xù)密度梯度法，2 000 r·min－1，20 min 水平離心后收集 Ficoll-Hypaque 液和細(xì)胞懸液間的腫瘤細(xì)胞。PBS洗1次，0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)活細(xì)胞率(藍(lán)染率＜10%)及細(xì)胞數(shù)，以含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋成1×108cells·L－1，加入 96 孔培養(yǎng)板，每孔 100 μl，待細(xì)胞貼壁后依實(shí)驗(yàn)要求加入不同濃度測(cè)試藥物CH和VER，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h后，加入MTT和DMSO，490 nm和630 nm雙波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(A)，并計(jì)算CH、VER對(duì)H22/FAP細(xì)胞的最大無毒劑量(抑制率＜10%)。

1.2.2耐藥倍數(shù)的測(cè)定和計(jì)算用MTT法測(cè)定肝癌H22/FAP細(xì)胞對(duì)ADR、CDDP、5-FU的耐藥倍數(shù)。分別抽取H22肝癌敏感小鼠和H22/FAP肝癌多藥耐藥小鼠的腹水瘤細(xì)胞，按方法“1.2.1”處理制得H22和H22/FAP腫瘤細(xì)胞并培養(yǎng)細(xì)胞，然后依實(shí)驗(yàn)要求加入不同濃度測(cè)試藥物 ADR、CDDP、5-FU，另設(shè)不加藥的空白對(duì)照組，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，加入MTT和DMSO，490 nm和630 nm雙波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(A)，并計(jì)算耐藥倍數(shù)(resistance index，RI)。

求出IC;RI=A/B，A為化療藥物對(duì)H22/FAP瘤細(xì)胞的IC50值;B為化療藥物對(duì)H22瘤細(xì)胞的IC50值。

1.2.3生命延長(zhǎng)率的評(píng)價(jià)方法♀ BALB/c小鼠腹腔接種H22/FAP細(xì)胞(每只0.2 ml，1×108cells·L－1)，隨機(jī)分成8組，每組10只:①生理鹽水(NS)組;②FAP+CH 20 mg·kg－1組;③FAP+CH 10 mg·kg－1組;④FAP+CH 5 mg·kg－1組;⑤FAP+VER 2.5 mg·kg－1組;⑥FAP+VER 1.25 mg·kg－1;⑦FAP+VER 0.75 mg·kg－1;⑧FAP 組;FAP給藥劑量按參考文獻(xiàn)給藥:0.5 LD50即5-FU 42.50 mg·kg－1，d1;ADR 2.10 mg·kg－1，d1;CDDP 1.40 mg·kg－1，d1 ～5;NS、CH、VER d1 ～7;均尾靜脈注射給藥。觀察小鼠生存時(shí)間，并計(jì)算生命延長(zhǎng)率。

1.2.4質(zhì)膜的制備♀ BALB/c小鼠腹腔接種H22/FAP 細(xì)胞(每只0.2 ml，1 ×108cells·L－1)，隨機(jī)分成9組，每組10只:①空白(NS)組;②FAP+CH 20 mg·kg－1組;③FAP+CH 10 mg·kg－1組;④FAP+CH 5 mg·kg－1組;⑤FAP+CH 2.5 mg·kg－1組;⑥FAP+VER 2.5 mg·kg－1;⑦FAP+VER 1.25 mg·kg－1;⑧FAP+VER 0.75 mg·kg－1;⑨FAP+VER 0.37 mg·kg－1;尾靜脈注射給藥，F(xiàn)AP給藥方案同“1.2.3”，7 d后抽取腹水瘤，按照MTT法中的步驟制取腫瘤細(xì)胞，加入 6 ml裂解液(mmol·L－1):Tris-HCl 10，pH 7.8，KCl 10，MgCl22，二硫蘇糖醇1，依他酸1)，在4℃下孵育20 min后，4 000×g下離心10 min，收集上清，100 000×g下離心1 h，取沉淀，加入含0.25 mol·L－1蔗糖的裂解液，備用。1.2.5P-gp ATP酶活性的測(cè)定每只實(shí)驗(yàn)小鼠取20 μg 質(zhì)膜，加入以下試劑(mmol·L－1):Tris-HCl 50(pH 6.8)，二硫蘇糖醇2，MgCl25，毒毛花苷2(清除Na+，K+-ATP酶活性)，依他酸2(清除Ca2+-ATP酶活性)，疊氮化鈉5(清除線粒體ATP酶活性)，然后加入 MgATP反應(yīng)開始。加入1 ml定磷試劑，37℃下反應(yīng)30 min，以725分光光度計(jì)測(cè)定720 nm下吸光度(A)值。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果取3次實(shí)驗(yàn)的均值，標(biāo)準(zhǔn)差均小于5%，組間顯著性檢驗(yàn)用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1CH、VER對(duì)H22/FAP細(xì)胞的最大無毒劑量MTT法檢測(cè)結(jié)果表明，CH和VER劑量為1.0、0.15 g·L－1時(shí)，對(duì)H22/FAP肝癌多藥耐藥細(xì)胞的抑制率＜10%;每只小鼠按0.02 ml·g－1劑量給藥，則每只小鼠的最大給藥量分別為20、3 mg·kg－1，此檢測(cè)結(jié)果為“1.2.3”和“1.2.4”給藥方案提供依據(jù)，確保CH與VER逆轉(zhuǎn)耐藥的作用，不是由細(xì)胞毒性所致。與參考文獻(xiàn)［13］結(jié)果基本一致。

2.2H22/FAP細(xì)胞對(duì)受試藥物的耐藥倍數(shù)如Tab 1所示，H22/FAP細(xì)胞對(duì) ADR、CDDP、5-FU 的耐藥倍數(shù)分別為27.75、10.20、11.20;實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明H22/FAP對(duì)誘導(dǎo)耐藥的3種藥物產(chǎn)生了較強(qiáng)耐藥性。

Tab 1 Drug sensitivity of H22/FAP tumor cells as determined by MTT(±s，n=3)

Tab 1 Drug sensitivity of H22/FAP tumor cells as determined by MTT(±s，n=3)

Drug IC50/mg·L－1 H22 H22/FAP RI ADR 0.12 ±0.12 3.33 ±0.54 27.75 CDDP 0.10 ±0.02 1.02 ±0.21 10.20 5-FU 6.36 ±0.23 71.23 ±0.24 11.20

2.3生命延長(zhǎng)率的評(píng)價(jià)結(jié)果CH 10 mg·kg－1、CH 5 mg·kg－1、VER 1.25 mg·kg－1組均可明顯延長(zhǎng)H22/FAP MDR小鼠的生存時(shí)間，生存天數(shù)分別為(29.46 ± 2.33)、(31.08±2.42)、(29.21±1.47)，與單純用化療藥的FAP組(20.89±1.21)對(duì)比，對(duì)小鼠的生命延長(zhǎng)率分別為41.0%、48.8%、39.8%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);CH 10 mg·kg－1組，CH 5 mg·kg－1組與陽(yáng)性對(duì)照藥 VER 1.25 mg·kg－1組對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);CH 20 mg·kg－1組(22.23 ± 1.56)，VER 2.5 mg·kg－1組(19.30 ± 2.01)，VER 0.75 mg·kg－1(22.20±1.20)組與FAP組對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。FAP組與NS組對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步證實(shí)FAP組已產(chǎn)生了耐藥性。見Fig 1。

Fig 1 Effect of CH and VER in combination with FAP on the survival time of BALA/c mice

2.4CH，VER對(duì)P-gp ATPase活性的影響VER能濃度依賴性地提高ATP酶活性，與常見文獻(xiàn)報(bào)道類同;CH能濃度依賴性地提高ATP酶活性。見Fig 2、3。

Fig 2 Effect of CH on upregulating ATPase activity

Fig 3 Effect of VER on upregulating ATPase activity

2.5 Cornish-Bowden圖把CH和VER的濃度標(biāo)在橫坐標(biāo)的負(fù)半軸，所測(cè)得的酶活性標(biāo)在縱坐標(biāo)上，繪制 Cornish-Bowden圖。CH對(duì) ATP酶的Km為1.11 mg·kg－1，Vmax為 184 nmol·(min·mg)－1;VER 對(duì) ATP 酶的Km為 0.34 mg·kg－1，Vmax為 190 nmol·(min·mg)－1，兩者的Vmax接近。見 Fig 4、5。

Fig 4 Cornish-Bowden plot:Effect of CH on ATPase activity

Fig 5 Cornish-Bowden plot:Effect of VER on ATPase activity

3 討論

P-gp在腫瘤多藥耐藥中起著關(guān)鍵作用，研究P-gp逆轉(zhuǎn)劑的作用機(jī)制可為克服P-gp介導(dǎo)的腫瘤多藥耐藥提供有價(jià)值的信息和思路。本研究在模擬臨床FAP方案，由本實(shí)驗(yàn)室建立BALB/c小鼠多藥耐藥模型的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討CH聯(lián)合FAP逆轉(zhuǎn)肝癌多藥耐藥的作用及其機(jī)制研究。本課題觀察了CH和VER聯(lián)合FAP對(duì)小鼠生存時(shí)間的影響，結(jié)果證實(shí)CH聯(lián)合FAP能延長(zhǎng)小鼠的生存時(shí)間，能夠部分逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞的多藥耐藥性。

細(xì)胞質(zhì)膜上的ATP酶包括 Na+，K+-ATP酶、Ca+-ATP酶、線粒體ATP酶和P-gp ATP酶，在二硫蘇糖醇、依他酸、毒毛花苷存在下，含P-gp的質(zhì)膜中所剩下的ATP主要為P-gp ATP酶。酶動(dòng)力學(xué)分析顯示，VER能夠提高P-gp ATP酶活性，與文獻(xiàn)報(bào)道一致;CH能濃度依賴性的提高ATP酶的活性，抑制P-gp的外排功能，從而逆轉(zhuǎn)肝癌多藥耐藥性。通過Cornish-Bowden作圖，可以看到，CH逆轉(zhuǎn)效果與文獻(xiàn)報(bào)道的陽(yáng)性對(duì)照藥維拉帕米差異無顯著性。其逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的機(jī)制之一可能為能夠提高P-gp ATP酶的活性，抑制P-gp的外排。另外，有文獻(xiàn)報(bào)道［14］通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)羅丹明123的蓄積和外排，證實(shí)漢防己堿逆轉(zhuǎn)耐藥的機(jī)制之一為抑制P-gp的外排，而CH與漢防己堿結(jié)構(gòu)類似，同屬雙芐基異喹啉類藥物，進(jìn)一步推測(cè)CH逆轉(zhuǎn)H22/FAP肝癌多藥耐藥的機(jī)制之一可能為影響P-gp的外排功能。

CH是一個(gè)具有開發(fā)前景和研究?jī)r(jià)值的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑，我們的研究表明，腫瘤化療中聯(lián)合使用CH對(duì)于糾正化療中出現(xiàn)的多藥耐藥現(xiàn)象是一種新的戰(zhàn)略方策，以此來增加腫瘤患者對(duì)產(chǎn)生耐藥的化療藥物的敏感性，對(duì)臨床腫瘤治療具有重要的理論和實(shí)踐意義，有可能成為克服肝癌化療多藥耐藥的一個(gè)新的解決途徑。

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