劉 浩，蔣琛琛，程 秀，方 琳，陳 超，張旭東，蔣志文

(蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，安徽省生化藥物工程技術(shù)研究中心，安徽蚌埠 233030)

白藜蘆醇(resveratrol，Res)，化學(xué)名稱(chēng)為 3，4 ，5-三羥基芪(3，4 ，5-trihydroxystilbene)，是非黃酮類(lèi)的多酚化合物。主要存在于葡萄、虎杖、藜蘆等植物中。1940年首次從毛葉葉黎蘆(Veratrum grandiortuaLoes)的根部分離得到，1977年在葡萄中發(fā)現(xiàn)Res作為植物抗毒素存在。有研究認(rèn)為從飲用葡萄酒中攝取Res是法國(guó)人心血管疾病發(fā)病率低的重要原因之一。隨后的研究發(fā)現(xiàn)Res其具有許多重要的生理活性，如:抗腫瘤、保護(hù)心血管系統(tǒng)、抗氧化等作用［1－2］。Res甚至被喻為繼紫杉醇之后又一新的綠色抗癌藥物。其存在的形式有順式和反式，植物中主要以反式存在，其生理活性強(qiáng)于其順式異構(gòu)體［3］。本研究旨在觀察反式Res對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞增殖的抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株人黑色素瘤細(xì)胞株 Mel-RM和MM200由Commonwealth Serum實(shí)驗(yàn)室提供(Australia)，本實(shí)驗(yàn)室保種。培養(yǎng)條件:含5%FCS的DMEM高糖型培養(yǎng)基，37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱。

1.2主要試劑白藜蘆醇(純度大于99.5%)，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，用DMSO溶解，母液濃度為80 mmol·L－1，－20℃避光保存;胎牛血清購(gòu)于杭州四季青公司;DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco公司;溴化丙啶(propidium iodide，PI)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;JC-1檢測(cè)試劑購(gòu)于美國(guó)Molecular Probes公司;Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞密度為1×107·L－1，接種于96孔板中，每孔200 μl，于 5%CO2、飽和濕度、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h。不同濃度(10、20、40、80、160 μmol·L－1)Res處理，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后每孔加入MTT(5 g·L－1)15 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入 DMSO 150 μl，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，微量振蕩器振蕩10 min使結(jié)晶物充分溶解，酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)下檢測(cè)每孔的吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞存活率:細(xì)胞存活率/%=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4PI染色應(yīng)用24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，接種細(xì)胞1×105個(gè)/孔，培養(yǎng)24 h后加Res，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集各孔培養(yǎng)液至對(duì)應(yīng)流式管中，用預(yù)冷PBS清洗每孔，收集清洗液至對(duì)應(yīng)培養(yǎng)液中，1200r·min－1離心10 min，棄上清;培養(yǎng)板中加入PI緩沖液(0.005 g PI、0.1g 檸檬酸鈉、100 μl Triton X-100、100ml dH2O)750μl/孔，37℃孵育10min，吹打收集細(xì)胞至對(duì)應(yīng)流式管中，輕輕搖動(dòng)混勻。4℃避光保存，過(guò)夜，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)具有亞G1期DNA含量的細(xì)胞比例，代表凋亡細(xì)胞數(shù)。

Fig 1 Res inhibits the proliferation of human melanoma cells

1.5JC-1染色接種細(xì)胞至24孔板，1.0×105/孔，培養(yǎng)過(guò)夜后給予Res處理細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，流式細(xì)胞儀檢測(cè)并進(jìn)行軟件分析。

1.6Caspase-3活性檢測(cè)按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)溫度為 37℃。取樣本 100 μl，Ac-DEVD-AMC(Caspase-3四肽熒光底物)10 μl加到HEPES緩沖液中，在37℃下作用1 h，應(yīng)用熒光分光光度計(jì)在波長(zhǎng)405 nm處測(cè)吸光度，以不加底物的樣本作空白，結(jié)果以吸光度值表示。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，各組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1Res對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞增殖的抑制作用實(shí)驗(yàn)中使用不同濃度的Res處理人黑色素瘤細(xì)胞株Mel-RM，MM200，使用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。結(jié)果表明，隨著 Res濃度的增加(10、20、40、80、160 μmol·L－1)，Mel-RM，MM200 細(xì)胞的存活率明顯減少，實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)了Res處理24、48、72 h后細(xì)胞的存活率，顯示，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，Res表現(xiàn)出對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，見(jiàn)Fig 1。

2.2Res誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞凋亡的作用根據(jù)MTT 結(jié)果，實(shí)驗(yàn)給予 80 μmol·L－1和 160 μmol·L－1兩個(gè)不同濃度的Res處理黑色素瘤細(xì)胞24 h，采用PI染色，流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示，Res可使黑色素瘤細(xì)胞出現(xiàn)subG1細(xì)胞增多，即出現(xiàn)凋亡峰。濃度為 80 μmol·L－1和 160 μmol·L－1的Res誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞的凋亡率分別為30.8%和49.9%(Mel-RM)，40.2%和67.2%(MM200)，較對(duì)照組明顯增加(P＜0.05)，見(jiàn)Fig 2。

2.3Res對(duì)黑色素瘤細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位的影響分別給予 80 μmol·L－1和 160 μmol·L－1的 Res處理黑色素瘤細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行JC-1染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位變化。Fig 3可見(jiàn)Res處理后Mel-RM和MM200的線(xiàn)粒體膜電位比例均明顯降低。

2.4Res對(duì)黑色素瘤細(xì)胞Caspase-3活性的影響根據(jù)Res對(duì)黑色素瘤細(xì)胞凋亡的影響作用，實(shí)驗(yàn)中給予 80 μmol·L－1和 160 μmol·L－1的 Res 分別處理Mel-RM和MM200細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞，按照Caspase-3活性試劑盒檢測(cè)Caspase-3活性，結(jié)果表明:Res刺激人黑色素瘤細(xì)胞后，Caspase-3活性有明顯的增強(qiáng)(P＜0.05)。

3 討論

近年來(lái)，黑色素瘤的發(fā)病率不斷的上升，給人類(lèi)的健康帶來(lái)巨大的威脅。早期診斷的黑色素瘤患者通常僅用手術(shù)治療即可取得良好的效果。而對(duì)播散的黑色素瘤，通常對(duì)目前所有的抗腫瘤藥物均不敏感，預(yù)后較差，其一年生存率僅為50%。因此探明黑色素瘤早期診斷的分子標(biāo)志，尋求安全有效的治療藥物十分迫切［4］。

越來(lái)越多的研究證明了白藜蘆醇對(duì)包括鼻咽癌，肝癌，肺癌，胃癌，前列腺癌.甲狀腺癌，白血病等多種腫瘤都有作用。對(duì)白藜蘆醇抗腫瘤活性機(jī)制的研究顯示，白藜蘆醇在腫瘤起始、促進(jìn)和發(fā)展3個(gè)階段都具有抑制效果。能夠抗突變，抗氧化，抑制自由基并誘導(dǎo)Ⅱ期藥代酶;能抑制環(huán)氧化酶(COX-2)，具有很強(qiáng)的抗炎作用;能誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。同時(shí)，白藜蘆醇還具有潛在的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用［5－6］。白藜蘆醇作用于高轉(zhuǎn)移卵巢癌細(xì)胞后能抑制細(xì)胞體外趨化運(yùn)動(dòng)和黏附能力，但不影響其侵襲人工基底膜的能力［7］。有文獻(xiàn)報(bào)道，白藜蘆醇對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞增殖具有誘導(dǎo)作用，并可誘導(dǎo)其凋亡［8－9］。本實(shí)驗(yàn)以人黑色素瘤細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察了白藜蘆醇體外誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞凋亡的作用及對(duì)Caspase-3的影響。

Fig 2 Res induces apoptosis in human melanoma cells

Fig 3 Effect of Res on the mitochondrial membrane potential(△Ψm)in Mel-RM and MM200 cells

Fig 4 Effect of Res on the activity of Caspase-3 in Mel-RM and MM200 cells

線(xiàn)粒體在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著樞紐作用，多種細(xì)胞凋亡刺激因子均可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，而線(xiàn)粒體跨膜電位的下降，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中最早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征(染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂)出現(xiàn)之前，一旦線(xiàn)粒體跨膜電位崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)［10－11］。本實(shí)驗(yàn)中使用親脂性陽(yáng)離子熒光染料 Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide(JC-1)進(jìn)行染色分析，JC-1可結(jié)合到線(xiàn)粒體基質(zhì)，其熒光的增強(qiáng)或減弱說(shuō)明線(xiàn)粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低［12－13］。白藜蘆醇對(duì)黑色素瘤細(xì)胞線(xiàn)粒體跨膜電位的影響也提示了其誘導(dǎo)凋亡的作用。但其降低線(xiàn)粒體跨膜電位誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制尚不明確，可能是線(xiàn)粒體膜電位變化直接激活線(xiàn)粒體途徑的凋亡通路。由于△Ψm下降，通過(guò)不同的途徑活化Caspase-3，從而引起細(xì)胞凋亡。

Caspases是一組由無(wú)活性的酶原合成的半胱氨酸蛋白酶，通過(guò)上游Caspases前體的裂解而激活，引起一組級(jí)聯(lián)反應(yīng)，Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程具有極為重要的作用，其中Caspase-8參與凋亡的起始，可剪切活化，而Caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能［14－15］。Caspase-3正常以前體(32 ku)的形式存在于胞質(zhì)中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個(gè)大亞基(17 ku)和兩個(gè)小亞基(12 ku)組成，裂解相應(yīng)的胞質(zhì)胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［16－17］。Caspase-3 可以催化底物 Ac-DEVD-pNA(acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide)產(chǎn)生黃色的pNA(p-nitroaniline)，從而可以通過(guò)測(cè)定吸光度來(lái)檢測(cè)Caspase-3的活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇在誘導(dǎo)人黑色素瘤細(xì)胞凋亡的過(guò)程中出現(xiàn)Caspase-3的活化。

本實(shí)驗(yàn)證明了白藜蘆醇對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，觀察了其對(duì)線(xiàn)粒體膜電位的影響及激活Caspase-3的作用，表明白藜蘆醇在黑色素瘤的治療中一定的價(jià)值，但其分子機(jī)制尚需進(jìn)一步的探討，且需毒性試驗(yàn)及體內(nèi)試驗(yàn)的研究支持。

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