邢 燕，葉山東，胡 聞，陳 珂，陳玉米，陳 燕，范愛紅

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院1.內(nèi)分泌科、2.病理科、3.腎內(nèi)科，安徽 合肥 230001)

近來不少動物實(shí)驗(yàn)和臨床研究顯示噻唑烷二酮類藥物(TZDs)，包括吡格列酮(pioglitazone，PIO)和羅格列酮等可明顯減少糖尿病動物及糖尿病患者尿白蛋白的排泄，對腎臟提供明確的保護(hù)作用［1］，但確切機(jī)制尚未明了，可能是多因素的，如改善血流動力學(xué)、抑制系膜增生和保護(hù)足細(xì)胞，抑制炎癥反應(yīng)等［2］。Podocalyxin(PCX)作為足突頂端質(zhì)膜的主要結(jié)構(gòu)部分，是足突頂膜區(qū)主要的帶負(fù)電荷的唾液酸蛋白，參與維持足細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和濾過屏障的完整。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察不同劑量PIO對糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用及其對腎小球足細(xì)胞相關(guān)分子PCX表達(dá)及經(jīng)尿排泄的影響，探討PIO對糖尿病大鼠足細(xì)胞的保護(hù)作用及其劑量依賴性，為臨床應(yīng)用PIO防治DN提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物健康清潔級♂ Sprague-Dawley(SD)大鼠50只，2月齡，體質(zhì)量(196±20)g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供〔合格證號:SCXK(皖)2005-001〕。實(shí)驗(yàn)期間，室溫控制在(19±1)℃，濕度48%，12 h交替照明，大鼠自由進(jìn)食飲水。

1.2藥品及試劑鹽酸吡格列酮由江蘇恒瑞公司提供(批號:07062551)，臨用時用生理鹽水溶解。尿白蛋白試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所(批號:20090320);肌酐測定試劑盒購自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司(批號:20100120);STZ購自Sigma公司(批號:S0130);PCX ELISA試劑盒購自R＆D公司(批號:201002);甘精胰島素購自賽諾菲－安萬特公司;PCX多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司(批號:bs1345R)，免疫組化Elivision TM-plus試劑盒(鼠/兔)購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自 TaKaRa公司(批號:DRR036A)，PCR試劑盒購自TaKaRa公司。

1.3儀器德國羅氏公司優(yōu)越型血糖儀，Unico UV-2600系列紫外分光光度計(jì)(美國)，DFM-96型10管放射免疫γ計(jì)數(shù)儀(安徽合肥眾成機(jī)電公司)，Biocell HT-1酶標(biāo)儀(奧地利)，Ultra2全自動糖化血紅蛋白分析儀(Primus公司，美國)，顯微鏡(日本OlympusBX41)，PCR 儀(Biometra gradient)，日產(chǎn)JEM-1230型透射電鏡。

2 方法

2.1糖尿病大鼠模型的制備和分組50只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，檢測血糖均正常。設(shè)立正常對照組(NC組，n=8)，其余42只大鼠禁食12 h后，在空腹?fàn)顟B(tài)下，鏈脲佐菌素(STZ)按65 mg·kg－1一次性腹腔注射。STZ臨用前用0.1 mmol·L－1無菌枸櫞酸緩沖液配制為6.5 g·L－1，pH 4.3。72 h后測血糖≥16.7 mmol·L－1為糖尿病大鼠模型，其中6只大鼠因不能耐受血糖急驟增高而死亡，余下36只大鼠全部造模成功。穩(wěn)定1周后，造模成功的36只大鼠隨機(jī)分4組:糖尿病模型組(模型組，DM組)、吡格列酮1組(DR1組)、吡格列酮2組(DR2組)和吡格列酮3組(DR3組)，每組各9只。DR1、DR2、DR3組分別予以吡格列酮10、20和30 mg·(kg·d)－1的混懸液灌胃，NC組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，每天1次，持續(xù)8周。為防止血糖過高或糖尿病酮癥酸中毒的發(fā)生，對于血糖過高者(＞33.3 mmol·L－1)給予皮下注射甘精胰島素0.5 U，視情況每周注射2～3次，維持血糖在 20～30 mmol·L－1。實(shí)驗(yàn)過程中DR3組1只大鼠死于尾部感染，DR1、模型組各有1只大鼠因血糖過高死亡，DR2組大鼠1只大鼠死于灌胃窒息。

2.2標(biāo)本留取注射STZ穩(wěn)定7 d后設(shè)為0周，開始分組干預(yù)治療。分別于0周、8周末留尿置于－40℃冰箱保存待測尿白蛋白(Alb)、視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)、PCX和肌酐。8周末各組大鼠在10%的水合氯醛腹腔注射麻醉下行腹主動脈插管收集血標(biāo)本檢測HbA1c、血脂和腎功能，然后留取左側(cè)腎臟，經(jīng)生理鹽水反復(fù)灌洗去除包膜后稱重，腎臟肥大指數(shù)(KI)=左腎重/體重(mg·g－1)，部分腎臟組織分離皮質(zhì)和髓質(zhì)，液氮保存待做PCR。

2.3實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的檢測放射免疫法測定尿Alb和RBP;苦味酸法檢測尿肌酐;親和層析HPLC系統(tǒng)檢測HbA1c;參考Kanno等［3］的方法利用酶聯(lián)免疫分析法檢測尿沉渣中的PCX。本實(shí)驗(yàn)均留取隨機(jī)尿，為消除尿量的差異，UPCX、UAlb、URBP均以尿肌酐(Ucr)校正，簡稱為 UPCR、UACR、URCR。

2.4腎臟病理取約1 mm3的腎皮質(zhì)組織塊，經(jīng)2.5%戊二醛固定，制作超薄切片，透射電鏡下觀察。超薄切片在20 000倍下拍攝10個視野，隨機(jī)測量連續(xù)8處腎小球毛細(xì)血管基底膜厚度，取平均值為GBM厚度(GBMT)。測量出基底膜的總長度設(shè)為X，基底膜上融合足突的總長度設(shè)為Y，以Y/X計(jì)算足突融合率(FPFR)。

2.5免疫組化檢測腎組織PCX水平Elivision法檢測腎組織PCX蛋白，每張切片在200倍下，隨機(jī)采集皮質(zhì)區(qū)10個視野，全自動圖像分析系統(tǒng) (Image pro plus 6.0)對圖像中的陽性反應(yīng)部位測定累積光密度(integrated optical density，IOD)及相應(yīng)面積，取IOD作為每張切片陽性物質(zhì)的相對含量。

2.6 RT-PCR檢測腎皮質(zhì)PCX mRNA水平TRIzol法提取腎皮質(zhì)總RNA，取2 μg總RNA，70℃溫浴10 min后立即放置冰上，加入RT mix經(jīng)37℃ 60 min，85℃ 5 min孵育，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用特異性引物對逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行半定量PCR。PCX上游引物5'-GCAGGGCTTTGAACCTCTTG-3'，下游引物5'-GCTCTGTGACACTCGGATTT-3'，目的片段長度為343 bp;反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min，95℃變性45 s，60.9℃退火 30 s，72℃延伸 1 min 的熱循環(huán)，循環(huán)38次后，終末72℃延伸7 min，以 GAPDH為內(nèi)參照。GAPDH上游引物5'-AGATCCACAACGGATACATT-3'，下游引物5'-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3'，目的片段為308 bp。取8 μl PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外燈下照相，Biosens 805型凝膠成像系統(tǒng)分析電泳條帶的光密度并以GAPDH校正作相對量分析，數(shù)值以PCX/GAPDH條帶光密度比值表示PCX mRNA產(chǎn)物的相對半定量值。

2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有計(jì)量資料以±s表示。同一時間點(diǎn)的多組分析采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，采用Pearson相關(guān)分析相關(guān)指標(biāo)，所有統(tǒng)計(jì)均用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行。

3 結(jié)果

3.1一般情況、血糖、及8周末HbA1c、血脂、腎功能實(shí)驗(yàn)觀察期間，各糖尿病大鼠均表現(xiàn)出多飲、多尿、多食以及體重減輕;各時間點(diǎn)血糖和8周末HbA1c均明顯高于NC組(P＜0.01組)，各糖尿病組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各吡格列酮組BUN、TG明顯低于模型組(P＜0.05)，DR2及DR3組HDL-C水平高于模型組(P＜0.05)，DR1組雖輕度升高但與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見Tab 1。

3.2各組UACR、URCR、UPCR、KI和GBMT比較0周時NC組與各糖尿病大鼠之間UACR、URCR和UPCR差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

8周末，各糖尿病組大鼠UACR，URCR、UPCR、KI和GBMT均明顯高于NC組(均P＜0.05);與模型組比較，各吡格列酮組UACR和URCR、KI和GBMT明顯降低(均P＜0.05)，且DR2組和DR3組明顯低于DR1組(均P＜0.05);DR2和DR3組UPCR明顯低于模型組(P＜0.01)，且DR2和DR3組低于DR1組(P＜0.05)，DR1組UPCR輕度降低，但與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見Tab 2。

3.3腎臟病理學(xué)變化8周末，電鏡下NC組基底膜結(jié)構(gòu)清晰，均勻一致，足突完整，基本無足突融合。與NC組相比，模型組大鼠腎小球毛細(xì)血管基底膜呈不規(guī)則增厚，結(jié)構(gòu)模糊不清，可見足突破壞、融合、消失，基底膜厚度(GBMT)及足突融合率(FPFR)均明顯高于NC組(均P＜0.05)。各PIO組腎小球基底膜厚度、足突融合率高于NC組，但明顯低于模型組 (均P＜0.05)，且 DR2及 DR3組低于 DR1組(均P＜0.05)，見 Fig 1。

3.4腎組織PCX蛋白的表達(dá)8周末，免疫組化顯示NC組腎小球PCX為棕黃色顆粒狀沿腎小球外周毛細(xì)血管袢呈強(qiáng)陽性分布。各糖尿病組腎小球PCX表現(xiàn)為分布不均，甚至部分消失，累積吸光度(IOD)較NC組明顯下降(P＜0.05)，模型組最低，DR1、DR2及DR3組均明顯高于模型組(P＜0.05)，且DR2及DR3組高于DR1組(P＜0.05)。見Fig 2。

Fig 1 The tissues pathological change of the five groups observed by electron microscope(×20 000)

Tab 1 Comparison of the levels of UPCR，UACR，URCR，BG，HbA1C，KI，SCr，BUN，TG，TC，HDL-C，LDL-C，F(xiàn)DFR and GBMT among five groups(±s，n=8)

Tab 1 Comparison of the levels of UPCR，UACR，URCR，BG，HbA1C，KI，SCr，BUN，TG，TC，HDL-C，LDL-C，F(xiàn)DFR and GBMT among five groups(±s，n=8)

NC:normal control;DM:diabetic model group;DR1，DR2，DR3:10，20，30 mg·kg－1·d－1pioglitazone.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs NC group at the same time point;#P ＜0.01，##P ＜0.05 vs DM group at the same time point

Parameter Time/wk NC DM DR1 DR2 DR3 BG/mmol·L－1 0 3.95 ±0.64 19.79 ±1.75＊＊ 20.03 ±2.33＊＊ 20.14 ±2.24＊＊ 19.91 ±2.11＊＊8 4.00 ±0.77 21.76 ±1.57＊＊ 22.26 ±2.02＊＊ 21.96 ±2.10＊＊ 21.83 ±1.89＊＊HbA1c/% 8 3.80 ±0.57 11.07 ±1.55＊＊ 10.55 ±1.24＊＊ 10.54 ±1.43＊＊ 10.49 ±1.10＊＊SCr/μmol·L－1 8 55.10 ±8.04 106.50 ±16.20＊＊ 93.18 ±13.06＊＊ 93.67 ±17.28＊＊ 98.30 ±13.64＊＊BUN/mmol·L－1 8 2.96 ±0.49 10.01 ±1.52＊＊ 8.12 ±1.02＊＊## 7.80 ±1.28＊＊## 7.16 ±0.88＊＊##TG/mmol·L－1 8 1.11 ±0.21 1.74 ±0.24＊＊ 1.43 ±0.35*# 1.43 ±0.10*# 1.41 ±0.39*#TC/mmol·L －1 8 1.25 ±0.27 1.57 ±0.35 1.55 ±0.29 1.53 ±0.39 1.48 ±0.35 HDL-C/mmol·L－1 8 1.24 ±0.22 0.71 ±0.11＊＊ 0.85 ±0.14＊＊ 0.93 ±0.23＊＊# 0.93 ±0.27＊＊#LDL-C/mmol·L－1 8 0.73 ±0.12 1.28 ±0.23＊＊ 1.12 ±0.25＊＊ 1.16 ±0.17＊＊ 1.09 ±0.18＊＊

Tab 2 Comparison of the levels of UPCR，UACR，URCR，BG，HbA1C，KI，SCr，BUN，TG，TC，HDL-C，LDL-C，F(xiàn)DFR and GBMT among five groups(±s，n=8)

Tab 2 Comparison of the levels of UPCR，UACR，URCR，BG，HbA1C，KI，SCr，BUN，TG，TC，HDL-C，LDL-C，F(xiàn)DFR and GBMT among five groups(±s，n=8)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs NC group at the same time point;#P ＜0.05，##P＜0.01 vs DM group at the same time point;△P ＜0.05 vs DR1 group at the same time point

UACR/mg·g－1 0 32.65 ±8.04 36.93 ±7.98 37.67 ±9.40 37.05 ±8.34 35.362 ±6.99 8 35.05 ±6.75 138.51 ±18.87＊＊ 107.53 ±18.36＊＊## 89.04 ±16.12＊＊##△ 89.93 ±16.46＊＊##△UPCR/μg·g－1 0 1.42 ±0.36 1.68 ±0.37 1.66 ±0.41 1.69 ±0.39 1.68 ±0.35 8 1.46 ±0.39 9.50 ±1.67＊＊ 8.62 ±1.46＊＊ 7.01 ±1.07＊＊##△ 7.33 ±2.40＊＊##△URCR/μg·g－1 0 13.96 ±3.84 12.95 ±2.95 14.54 ±1.97 14.21 ±2.32 15.11 ±3.03 8 15.78 ±4.41 52.99 ±7.54＊＊ 44.75 ±6.59＊＊# 37.55 ±7.81＊＊##△ 35.58 ±4.55＊＊##△KI/×10－3 8 3.07 ±0.43 6.11 ±0.62＊＊ 5.29 ±0.73＊＊## 4.74 ±0.36＊＊##△ 4.72 ±0.36＊＊##△GBMT/nm 8 101.79 ±15.70 294.07 ±29.31＊＊ 210.43 ±16.83＊＊## 132.03 ±17.98*##△ 129.66 ±18.3*##△FPFR 8 0.03 ±0.02 0.87 ±0.04＊＊ 0.73 ±0.04＊＊## 0.51 ±0.05＊＊##△ 0.47 ±0.04＊＊##△

Fig 2 Comparison of expression of PCX protein among the five groups(Immunohistochemistry×400)

3.5腎皮質(zhì)PCX mRNA的表達(dá)8周末，與模型組比較，DR1、DR2、DR3組PCX mRNA均較模型組升高(P＜0.05)，但低于NC組(P＜0.05)，各 PIO組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見Fig 3。

3.6相關(guān)分析UPCR與UACR和KI呈正相關(guān)(r=0.86，r=0.83，P＜0.01)。

4 討論

PPAR-γ作為核受體超家族成員，是一類由配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，TZDs-吡格列酮作為PPAR-γ受體的高選擇性、強(qiáng)效激動劑，兩者結(jié)合后可激活PPAR-γ通路，提高胰島素敏感性和改善脂肪代謝。近來一些研究報道TZDs-吡格列酮在改善代謝紊亂、提高胰島素敏感性的同時，可降低尿白蛋白排泄，對DN發(fā)生發(fā)展有較好的防治作用，其確切的機(jī)制目前尚未闡明。本研究結(jié)果顯示STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠8周末尿白蛋白(反映腎小球病變)和視黃醇結(jié)合蛋白(反映腎小管-間質(zhì)損害)排泄明顯增多。與模型組比較，吡格列酮干預(yù)治療8周后UACR及URCR均明顯降低，同時腎臟肥大指數(shù)及病理指標(biāo)(基底膜厚度和足突融合率)明顯降低，中高劑量組優(yōu)于低劑量組，但中、高劑量組間差異無顯著性，進(jìn)一步證實(shí)了TZDs對腎臟的保護(hù)作用并具有一定的劑量依賴性。吡格列酮組與模型組血糖及HbA1c水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示吡格列酮的腎臟保護(hù)作用不依賴于血糖的降低，與文獻(xiàn)報道一致［4－5］。臨床觀察顯示糖尿病患者常合并脂代謝紊亂，吡格列酮干預(yù)治療可明顯改善脂代謝［6］。我們的研究顯示，8周末各組糖尿病大鼠TG，LDL-C升高，HDL-C下降，與文獻(xiàn)報道一致［7］。吡格列酮組TG水平較模型組明顯下降，并且發(fā)現(xiàn)中高劑量干預(yù)可明顯抑制HDL-C水平的降低。低劑量組HDL-C雖較模型組有所升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示吡格列酮在改善高脂血癥方面的作用可能存在一定的劑量依賴性。對此尚待進(jìn)一步延長觀察時間，并擴(kuò)大樣本量深入研究。

Fig 3 Comparison of expression of PCX mRNA among the five groups by RT-PCR

目前研究認(rèn)為TZDs的腎臟保護(hù)作用部分可能與其對腎小球足細(xì)胞的保護(hù)有關(guān)［8－9］。PCX作為足細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，是一種CD34相關(guān)性唾液酸糖蛋白，參與維持足細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)及濾過膜電荷屏障。PCX基因敲除的大鼠無法形成足突［10］。Hara等［11］研究證實(shí)足細(xì)胞損傷后，尿沉渣中PCX含量增加。本研究顯示糖尿病大鼠8周末腎組織PCX蛋白和mRNA表達(dá)較正常對照組明顯降低，尿PCX排泄增加，且尿PCX與尿白蛋白呈正相關(guān)，提示足細(xì)胞損害參與蛋白尿及糖尿病腎小球硬化的發(fā)生。進(jìn)一步觀察顯示，各吡格列酮組8周末腎組織PCX蛋白及mRNA表達(dá)明顯高于模型組，尿PCX排泄明顯降低(DR2及DR3組尿PCX排泄明顯減低，DR1組雖低于模型組但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，提示早期吡格列酮干預(yù)可抑制糖尿病大鼠腎小球PCX蛋白及mRNA表達(dá)的下調(diào)，抑制大鼠PCX經(jīng)尿的排泄，且中、高劑量組優(yōu)于低劑量組，而中、高劑量組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步證實(shí)這一作用具有一定的劑量依賴性，20 mg·(kg·d)－1吡格列酮可使 PPARγ 結(jié)合位點(diǎn)充分飽和，再增高劑量不能進(jìn)一步提高治療效果。有關(guān)吡格列酮抑制PCX表達(dá)下調(diào)，保護(hù)足細(xì)胞的機(jī)制尚未明確。體外研究發(fā)現(xiàn)［12］高糖可經(jīng)ERK1/2通路下調(diào)小鼠腎小球足細(xì)胞PCX蛋白的表達(dá);PPAR-γ激動劑［13］可抑制AT1受體表達(dá)和AngⅡ介導(dǎo)的信號通路，阻斷RAS系統(tǒng)的活化并保護(hù)足細(xì)胞。Miyata等［14］報道吡格列酮可通過抑制終末糖基化產(chǎn)物的生成發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。另外，體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)了吡格列酮的抗炎作用［15－16］。Miglio等［17］報道吡格列酮可下調(diào)減少TGF-β的表達(dá)，并減少足細(xì)胞的凋亡，抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞肥大［18］。Toblli等［5］研究還證實(shí)吡格列酮可通過抗氧化應(yīng)激及抗炎來延緩糖尿病大鼠腎纖維化。上述研究顯示，吡格列酮可能通過多種途徑來保護(hù)糖尿病腎病，其確切機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

本研究在為期8周的觀察中發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，低劑量吡格列酮組尿PCX排泄輕度降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與研究周期偏短有關(guān)，有待進(jìn)一步延長觀察時間。

總之，我們的研究初步證實(shí)吡格列酮可明顯降低足細(xì)胞標(biāo)志蛋白PCX隨尿排泄，抑制腎組織PCX蛋白及mRNA表達(dá)的下調(diào)，這一腎臟保護(hù)作用具有一定的劑量依賴性，其確切機(jī)制尚待進(jìn)一步探討。

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