許碧蓮，徐道華，陳文雙，崔 燎

(廣東醫(yī)學院1.藥理教研室、2.廣東天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室，廣東湛江 524023)

糖皮質激素具有抗炎、免疫抑制與抗過敏、抗休克等作用，臨床上用于嚴重感染或炎癥、自身免疫性疾病、過敏性疾病、呼吸系統(tǒng)疾病等，但長期應用可導致骨質疏松，增加骨折發(fā)生率［1］。如何防治糖皮質激素誘發(fā)骨質疏松(glucocorticoid induced osteoporosis，GIOP)，是目前各學者研究的重點課題之一。小檗堿(berberine，BBR)又稱黃連素，是一種異喹啉類生物堿，可從中草藥黃連、黃柏中提取的化合物，具有抗炎、抗腫瘤、抗消化性潰瘍、降血糖和調血脂等作用［2－3］。本課題組前期的實驗結果顯示［4］，小檗堿可防治糖皮質激素誘發(fā)的大鼠脛骨上段松質骨的骨丟失，但對腰椎松質骨和脛骨中段皮質骨是否也有防治作用，尚未進一步的研究。本文通過骨組織形態(tài)計量學方法探討小檗堿對糖皮質激素性骨質疏松大鼠腰椎松質骨和脛骨中段皮質骨的作用，并探討其作用機制，為把小檗堿開發(fā)成抗骨質疏松藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥品及儀器小檗堿購自Sigma公司;醋酸潑尼松購自浙江仙琚制藥股份有限公司;碳酸鈣維D片(每片含碳酸鈣750 mg，維生素D3100 U)購自美國安士制藥公司;鹽酸四環(huán)素、鈣黃綠素、Goldner’s染料購自美國Sigma公司。低速鋸(Buehler LTD，USA);硬組織切片機(德國Leica 2155);碳化鎢剛刀(德國Leica);自動化圖像數(shù)字化分析儀包括光鏡和熒光顯微鏡(Nikon，日本);骨組織形態(tài)計量學測量軟件(KSS Scientific Consultants，USA)。

1.2動物及其分組3月齡♂ SD大鼠共60只(SPF級，廣東醫(yī)學院實驗動物中心提供)，體質量(270±15)g。大鼠隨機分成6組:正常對照(CON)組、潑尼松(Pred)組、潑尼松加碳酸鈣維D(Pred+Ca+VitD)組、潑尼松加小檗堿低劑量〔Pred+BBR(L)〕組、小檗堿中劑量〔Pred+BBR(M)〕組、小檗堿高劑量〔Pred+BBR(H)〕組，每組10只。CON組給予溶劑對照溶液，其它5組先用潑尼松3.5 mg·kg－1·d－1造模，1 h 后再分別給予溶劑對照溶液、碳酸鈣 375 mg·kg－1·d－1及維生素 D350 U·kg－1·d－1、BBR 15、30、60 mg·kg－1·d－1。大鼠每次按 5 ml·kg－1灌胃給藥，連續(xù)給藥12周。每周稱體重1次，并按體重變化調整給藥量。所有動物在處死前d 14、13和d 4、3分別皮下注射鈣黃綠素7.5 mg·kg－1進行體內熒光標記。實驗結束時，大鼠麻醉后心臟抽血處死，迅速取出左側脛骨及第5腰椎，以備進行下列骨形態(tài)計量學的測定。

1.3骨組織形態(tài)計量學測定取第5腰椎，用低速鋸暴露骨髓腔，進行固定、脫水、包埋，按文獻［5］制成 5 μm 和 8 μm 切片，5 μm 骨薄片采用 Masson-Goldner-Trichrome染色，染色后測量骨形態(tài)計量學靜態(tài)參數(shù)和吸收參數(shù)，8 μm骨厚片直接封片測量有關動態(tài)參數(shù)，然后按公式［6］計算出相應的參數(shù)。取脛骨中段進行固定、脫水、包埋，按文獻［7］制成40 μm左右的骨片，然后測量皮質骨有關動靜態(tài)參數(shù)，按公式［6］計算出相應的參數(shù)。

1.4統(tǒng)計學方法計量資料以±s表示，SPSS11.5軟件行方差分析并行組間比較。

2 結果

2.1各組大鼠腰椎松質骨的變化

2.1.1各組大鼠腰椎松質骨靜態(tài)和吸收參數(shù)的變化與 CON組比較，Pred組腰椎骨小梁厚度(Tb.Th)降低(P＜0.05)，吸收參數(shù)每毫米破骨細胞數(shù)(Oc.N)、破骨細胞貼壁周長(Oc.S.Pm)均增加(P＜0.05)，但骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)無明顯變化(P＞0.05)。與Pred組比較，碳酸鈣維D和小檗堿3個劑量使Tb.Th增加(P＜0.05)，使Oc.N和Oc.S.Pm降低(P＜0.05)。小檗堿3個劑量組之間差異無顯著性(P＞0.05)。見Tab 1。

與CON組比較，Pred組大鼠腰椎松質骨的骨量減少，碳酸鈣維D和小檗堿可預防潑尼松所致骨量的減少。見Fig 1。

2.1.2各組大鼠腰椎松質骨動態(tài)參數(shù)的變化與CON組比較，Pred組腰椎標記周長百分數(shù)(%L.Pm)、骨礦化沉積率(MAR)、3種骨形成率(BFR/TV、BFR/BV、BFR/BS)均降低(P＜ 0.05，P＜0.01)。與Pred組比較，碳酸鈣維D和小檗堿3個劑量使動態(tài)參數(shù)均增加(P＜0.05，P＜0.01)。小檗堿中劑量組%L.Pm、BFR/TV、BFR/BV、BFR/BS較CON組增加明顯，但與低劑量組和高劑量組之間差異無顯著性(P＞0.05)。見Tab 2。

2.1.3各組大鼠腰椎生長板縱向生長熒光標記的變化與CON組比較，Pred組腰椎生長板熒光標記間距縮小。碳酸鈣維D和小檗堿3個劑量可預防潑尼松所致腰椎生長板熒光標記間距縮小。見Fig 2。

2.2各組大鼠脛骨中段皮質骨的變化

2.2.1各組大鼠脛骨中段皮質骨靜態(tài)參數(shù)的變化與CON組比較，Pred組脛骨中段骨組織總面積(T.Ar)、皮質骨面積(Ct.Ar)均減少(P＜0.05)，但骨髓腔面積(Ma.Ar)、皮質骨面積百分數(shù)(%Ct.Ar)和骨髓腔面積百分數(shù)(%Ma.Ar)無變化(P＞0.05)。與Pred組比較，碳酸鈣維D組和小檗堿3個劑量組均無變化(P＞0.05)。見Tab 3。

2.2.2各組大鼠脛骨中段皮質骨的動態(tài)變化與CON組比較，Pred組皮質骨的骨外膜的熒光減少。碳酸鈣維D和小檗堿3個劑量對皮質骨均無影響。見Fig 3。

Fig 1 Micrographs of the sagittal section of fifth lumbar vertebrae(LV5)in different groups of rats(Goldner’s Trichrome staining ×10)

Fig 2 Micrographs of interlabeled width of growth plate of LV5 in different groups of rats(×100)

Tab 1 The changes of static and absorption parameters of LV5 in rats in each group(±s，n=10)

Tab 1 The changes of static and absorption parameters of LV5 in rats in each group(±s，n=10)

*P＜0.05 vs control;△P＜0.05 vs Pred

Group Tb.N/No.·mm －1 Tb.Th/μm Tb.Sp/μm Oc.N/No.·mm －1Oc.S.Pm/%Control 3.3 ±0.4 94.3 ±13.4 211.9 ±22.5 0.16 ±0.04 0.31 ±0.10 Pred 3.2 ±0.3 82.3 ±6.0* 230.1 ±29.8 0.38 ±0.06* 0.58 ±0.11*Pred+Ca+VitD 3.1 ±0.4 104.8 ±15.3△ 223.2 ±39.1 0.21 ±0.06△ 0.33 ±0.11△Pred+BBR(L)3.2 ±0.2 102.8 ±15.3△ 211.6 ±20.1 0.21 ±0.05△ 0.34 ±0.10△Pred+BBR(M)3.2 ±0.4 100.9 ±19.4△ 214.8 ±25.1 0.20 ±0.05△ 0.33 ±0.11△Pred+BBR(H)3.2 ±0.3 98.4 ±11.3△ 219.2 ±26.6 0.20 ±0.06△ 0.32 ±0.13△

Tab 2 The changes of dynamic parameters of LV5 in rats in each group(±s，n=10)

Tab 2 The changes of dynamic parameters of LV5 in rats in each group(±s，n=10)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control;△P＜0.05，△△P＜0.01 vs Pred

Group %L.Pm/% MAR/μm·d－1 BFR/TV/%·year－1 BFR/BV/%·year－1 BFR/BS/%·year －1 Control 6.15 ±2.11 1.17 ±0.13 14.17 ±4.50 45.82 ±13.41 2.59 ±0.86 Pred 1.83 ±1.22＊＊ 1.02 ±0.11* 3.62 ±2.46＊＊ 13.73 ±10.58＊＊ 0.68 ±0.49＊＊Pred+Ca+VitD 4.79 ±1.43△ 1.14 ±0.11△ 10.39 ±4.22△△ 34.17 ±13.38△△ 2.00 ±0.68△△Pred+BBR(L)4.05 ±1.08△ 1.05 ±0.18 8.35 ±2.40△△ 26.21 ±8.44△ 1.56 ±0.43△△Pred+BBR(M)7.11 ±1.89△△ 1.26 ±0.09△ 17.36 ±4.25△△ 58.78 ±14.59△△ 3.28 ±0.92△△Pred+BBR(H)5.32 ±2.73△ 1.18 ±0.17△ 12.29 ±6.93△△ 39.96 ±23.95△△ 2.36 ±1.46△△

Tab 3 The changes of static paramerers of Tx in rats in each group(±s，n=10)

Tab 3 The changes of static paramerers of Tx in rats in each group(±s，n=10)

*P＜0.05 vs control

Group T.Ar/mm2 Ct.Ar/mm2 Ma.Ar/mm2%Ct.Ar/% %Ma.Ar/%Control 6.06 ±0.31 4.93 ±0.25 1.10 ±0.14 81.94±1.87 18.06 ±1.87 Pred 5.61 ±0.36* 4.55 ±0.39* 1.06 ±0.16 80.98 ±2.94 19.02 ±2.94 Pred+Ca+VitD 5.72 ±0.57 4.64 ±0.40 1.08 ±0.25 81.31 ±2.94 18.69 ±2.97 Pred+BBR(L)5.92 ±0.53 4.80 ±0.49 1.12 ±0.14 81.01 ±2.08 18.98 ±2.08 Pred+BBR(M)5.62 ±0.43 4.55 ±0.33 1.08 ±0.16 80.93 ±2.00 19.07 ±2.00 Pred+BBR(H)5.78 ±0.29 4.68 ±0.30 1.07 ±0.09 81.30 ±1.72 18.70 ±1.72

Fig 3 Micrographs of the dynamic changes of the tibial shaft(Tx)in different groups in rats(×40)

3 討論

骨質疏松癥是以骨量減少、骨的微觀結構退化為特征，致使骨的脆性增加，易發(fā)生骨折的一種全身性骨骼疾病。骨質疏松癥分為原發(fā)性、繼發(fā)性和特發(fā)性骨質疏松。繼發(fā)性骨質疏松是由其它疾病或藥物等因素誘發(fā)的骨質疏松，GIOP是最常見的繼發(fā)性骨質疏松，其發(fā)病率僅次于絕經(jīng)后骨質疏松及老年性骨質疏松而居第3位，GIOP患者受到輕微外力骨折的風險增加30%～40%，發(fā)生骨折的部位主要在腰椎及髖骨等。

由Tab 1和Fig 1的結果可見，潑尼松組大鼠腰椎松質骨的骨量減少，骨小梁厚度降低，但每毫米破骨細胞數(shù)、破骨細胞貼壁周長均增加。由Tab 2的結果可見，潑尼松組腰椎松質骨標記周長百分數(shù)、骨礦化沉積率、骨形成率均降低。由Fig 2的結果可見，潑尼松組腰椎生長板縱向生長熒光標記間距明顯縮小。結果提示，潑尼松既抑制大鼠腰椎松質骨的骨形成和骨礦化，又促進骨吸收，但以抑制骨形成為主，導致松質骨的丟失。糖皮質激素誘發(fā)骨丟失的可能機制為［8－9］:①激素可直接抑制成骨細胞的產(chǎn)生，加速成骨細胞的凋亡，同時可抑制胰島素樣生長因子在成骨細胞的表達，降低骨的轉換率。②繼發(fā)性甲狀旁腺素分泌增加，激活破骨細胞，促進骨吸收，導致骨量減少。③抑制胃腸道對鈣的吸收，增加鈣磷的排泄。④可引起睪酮缺乏，抑制十二指腸跨膜鈣離子轉運載體活性，減少鈣離子結合蛋白的合成，導致腸道鈣吸收障礙，繼而抑制骨形成，促進骨吸收。⑤抑制雌激素分泌，降低鈣磷在骨質的沉著。⑥引起脂質代謝異常，造成骨髓微脂肪栓形成，骨髓微循環(huán)壓力增高，骨缺血壞死。

由Tab 3的結果可見，潑尼松使脛骨中段骨組織總面積、皮質骨面積均減少。由Fig 3的結果可見，潑尼松使皮質骨的骨外膜的熒光減少。提示潑尼松抑制皮質骨的骨外膜的骨形成，導致骨代謝的負平衡，皮質骨量減少，脛骨中段變小。文獻報道［10］，糖皮質激素對大鼠皮質骨的影響主要是使骨外膜面的骨形成減少，并使骨內膜面的骨吸收增加，從而導致皮質骨變薄，骨髓腔增大。但本實驗結果顯示潑尼松對骨髓腔面積、骨內膜的骨形成無影響，提示潑尼松對皮質骨的骨內膜影響不大，具體機制有待于進一步研究。

由結果可見，碳酸鈣維D使?jié)娔崴纱笫笱邓少|骨的骨量、骨小梁厚度、標記周長百分數(shù)、骨礦化沉積率、骨形成率均增加，而使骨吸收參數(shù)降低，提示碳酸鈣加維生素D可預防糖皮質激素誘發(fā)的松質骨的骨丟失。碳酸鈣加維生素D預防骨丟失的機制為［11］:①碳酸鈣補充骨礦物質，促進骨礦化，利于骨形成;②維生素D3能增加小腸吸收飲食中鈣和磷，維持鈣磷平衡。在骨重建過程中，維生素D3可增加成骨細胞活性。③維生素D3合并小劑量鈣，能增加小腸對鈣的吸收，補充礦物質，預防骨量丟失和減少骨折的發(fā)生。

由結果可見，小檗堿 15、30、60 mg·kg－1·d－1均使?jié)娔崴纱笫笱邓少|骨的骨量、骨小梁厚度、標記周長百分數(shù)、骨礦化沉積率、骨形成率均增加，而使骨吸收參數(shù)降低，提示小檗堿可預防GC誘發(fā)的腰椎松質骨的骨丟失，主要是通過促進骨形成，抑制骨吸收而實現(xiàn)的。小檗堿為中草藥黃連、黃柏中的主要活性成分，文獻報道［12］，小檗堿可通過抑制骨吸收預防去卵巢大鼠的脛骨上段松質骨的丟失。黃柏小檗堿可增加去卵巢大鼠股骨干骺端的骨密度，其機制可能是抑制骨吸收、促進骨形成，促進雌二醇和降鈣素合成［13］。小檗堿可促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化，增強骨鈣化［14］。小檗堿通過p38 MAPK激活 Runx2而促進成骨細胞分化［15］。小檗堿抑制抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)陽性多核破骨細胞的形成和TRAP活性，減少破骨性骨吸收陷窩的面積，提示小檗堿通過抑制破骨細胞的形成、分化和骨吸收功能減少骨質的丟失［16］。小檗堿還可能通過上調肝臟Insig-2基因表達，抑制肝臟中膽固醇的合成代謝，發(fā)揮調節(jié)血脂作用［17］，從而改善糖皮質激素所致血脂代謝異常［18］，預防糖皮質激素誘發(fā)的骨丟失和骨壞死。

由Tab 2的結果可見，小檗堿30 mg·kg－1·d－1中劑量組%L.Pm、BFR/TV、BFR/BV、BFR/BS雖然較正常對照組增加明顯，但與15 mg·kg－1·d－1低劑量組和 60 mg·kg－1·d－1高劑量組之間無統(tǒng)計學意義，提示小檗堿3個劑量的作用效果相似，在15 ～60 mg·kg－1·d－1劑量范圍內沒有劑量相關性。小檗堿的劑量相關性還有待于進一步的探索。

由結果可見，碳酸鈣維 D和小檗堿15、30、60 mg·kg－1·d－1對潑尼松大鼠脛骨中段皮質骨各項參數(shù)均無影響，提示碳酸鈣維D和小檗堿不能預防糖皮質激素誘發(fā)的大鼠皮質骨的骨丟失?？赡苁怯捎谄べ|骨對藥物反應程度不如松質骨敏感，抗骨質疏松藥物如氟化物、雙膦酸鹽類以及PTH對皮質骨的效果也均不明顯［19］。

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