榮 健，葉 升，肖亮燦，郭俊英，梁孟亞，劉 海，黃偉明，吳鐘凱

(中山大學附屬第一醫(yī)院1.麻醉科、2.腫瘤科、3.心臟外科，廣東 廣州 510000)

肺缺血/再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)引起的肺功能障礙，是體外循環(huán)心臟手術(shù)后最常見的并發(fā)癥和導致死亡的主要原因之一［1］。由于未成熟肺組織的特殊解剖生理學特點，使其在體外循環(huán)期間更易于受到損傷［2］。烏司他丁(ulinastatin，UTI)是從男性尿中分離純化的尿胰蛋白酶抑制劑，有很強的抑制水解酶的作用，能改善休克時的循環(huán)狀態(tài)、對溶酶體膜起穩(wěn)定作用、抑制炎癥介質(zhì)的釋放等功能，對內(nèi)毒素引起的肺損傷具有保護作用［3］，但其可能的機制尚未不清楚。水通道蛋白(aquaporin，AQPs)是近年來的研究熱點之一，它選擇性地分布在與體液吸收或分泌有關(guān)的上皮細胞及可能協(xié)同液體跨細胞轉(zhuǎn)運的內(nèi)皮細胞中，執(zhí)行著各部位的水分重吸收、液體分泌和細胞內(nèi)外水平衡功能。AQPs有多種亞型，目前研究較多的水通道蛋白1(AQP1)具有清除支氣管和脈管周圍組織水分的作用［4］。研究表明，AQP1 參與腺病毒［5］、LPS［6］和高氧性［7］肺損傷中的病理性肺水腫過程。但在體外循環(huán)肺缺血/再灌注損傷中的作用未見報道。本研究采用新生豬體外循環(huán)模型，觀察烏司他丁對新生豬體外循環(huán)肺缺血/再灌注后AQP1的影響，以期從分子水平探討烏司他丁肺保護機制，尋求抑制體外循環(huán)肺缺血/再灌注損傷的新靶點。

1 材料與方法

1.1實驗動物平均體質(zhì)量4.9(S=0.6)kg，年齡＜1月的健康新生五指山小香豬12只(廣東省實驗動物監(jiān)測所提供)，♀♂不限，依據(jù)主動脈開放前是否經(jīng)肺動脈給予烏司他丁，隨機分為對照組和實驗組，每組6只。實驗組在主動脈開放前通過肺動脈注射烏司他丁10 000 U·kg－1。

1.2麻醉方法及手術(shù)過程肌肉注射氯胺酮40 mg·kg－1和芬太尼 2 μg·kg－1，靜脈注射維庫溴銨0.1 mg·kg－1行氣管插管，呼吸機維持機械呼吸(潮氣量 13 ～15 ml·kg－1，呼吸頻率12 ～16 次/分)，股動、靜脈分別插管測平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)及中心靜脈壓(central venous pressure，CVP)。胸骨正中劈開，切開心包，右心房內(nèi)注射肝素3 mg·kg－1，主動脈和上下腔靜脈分別插入10F和12F插管，連接人工心肺機。升主動脈根部插入并固定16號針頭，連接灌注裝置。采用3M人工心肺機，polystan safe micro膜肺，Sarns變溫水箱以及東莞科威醫(yī)療儀器廠的塑料管道。兩組均以羥乙基淀粉130/0.4氯化鈉注射液預充，預充總量(110±23)ml。

1.3CPB管理兩組新生豬CPB開始后，維持流量180 ～220 ml·(min·kg)－1，并體循環(huán) 10 min，阻斷升主動脈后在主動脈根部灌注4℃改良 ST.Tomas停跳液 15 ml·kg－1，阻斷升主動脈60 min后開放升主動脈，開放后輔助循環(huán)90 min。開放主動脈后如心臟出現(xiàn)室顫者使用交流電除顫復跳。

1.4標本采集及檢測指標在開胸后即刻(T1)、主動脈開放90 min實驗結(jié)束前(T2)分別留取標本。通過奧林巴斯纖維支氣管鏡向右肺中葉注入生理鹽水10 ml后負壓6.65～13.3 kPa吸引，灌注4次，灌注液總量為40 ml，回收率＞40%為有效。所取肺灌洗液即刻以1 000 r·min－1離心 10 min，上清液－70℃保存。左下肺組織部分以3.33 mol·L－1中性甲醛固定，部分－80℃ ～－70℃保存。肺靜脈血上清液－80℃ ～－70℃保存。肺組織進行HE染色，石蠟切片，光鏡下觀察病理變化。將肺泡灌洗液離心所得沉淀用0.5 PBS液懸浮，取10 μl在玻片上制成直徑約1 cm的細胞涂片，瑞氏－姬姆薩染色，光學顯微鏡下計數(shù)全片中性粒細胞(PMN)，按標準體積換算濃度。ELISA法(美國MDI公司)測定肺靜脈血上清液IL-6和TNF-α含量。肺組織于4℃生理鹽水中漂洗，剔除結(jié)締組織，濾紙吸干表面水分，分析天平稱濕重，然后置80℃溫箱內(nèi)，48 h后稱干重，計算 W/D。免疫組化采用濃縮型兔抗羊AQP1多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology，Inc)及超敏即用型S2P通用型免疫組織化學試劑盒(Maxim Biotech.Inc)。AQP1相關(guān)抗原以細胞膜或細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應。陰性對照除細胞核染成藍色外，胞核和胞質(zhì)內(nèi)無棕黃色反應物。應用Image-Pro Plus 6.0進行圖像半量分析，每張切片隨機選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野(×400)，評價指標采用AQP1累計光密度率(IOD率，the percentage of integrated optical density)，即AQP1累計光密度與視野實質(zhì)累計光密度的比率。以每例5個視野的平均AQP1累計光密度率作為該例的測量值。提取肺組織總蛋白，Western blot檢測肺組織AQP1蛋白表達，以β-actin蛋白表達做為內(nèi)參，成像系統(tǒng)進行分析和掃描，結(jié)果以光密度比值表示。

1.5統(tǒng)計學方法所有計量數(shù)據(jù)運用±s進行統(tǒng)計描述分析，應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)數(shù)據(jù)運用百分位數(shù)進行統(tǒng)計描述分析。為檢驗組間差異，對計數(shù)數(shù)據(jù)(discrete variable)組間比較，采用兩個獨立樣本非參數(shù)檢驗(two independent samples tests);對計量數(shù)據(jù)(measurement data)，采用兩樣本t檢驗(independent samplesttest)。對重復測量數(shù)據(jù)比較采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析(repeated measures analysis of variance)。

2 結(jié)果

2.1烏司他丁對新生豬體外循環(huán)缺血/再灌注后90 min肺組織病理變化(HE染色)的影響兩組豬肺組織在實驗結(jié)束時均出現(xiàn)炎性細胞滲出、肺間質(zhì)水腫、肺間隔增厚、肺泡融合等病理改變，但實驗組組織病理學損傷程度相對較輕。依據(jù)半定量方法［8］對肺損傷進行5級分類:0:無損傷;1:輕度損傷;2:中度損傷;3:嚴重損傷。400倍光鏡下任取10個視野，計算平均每個視野所得分均值代表損傷程度。組間比較，T2時點兩組肺損傷評分:(1.4±0.20vs2.8±0.11，實驗組vs對照組)，P＜0.05。見Fig 1。

Fig 1 Lung injury of two groups by HE staining (×400)

2.2烏司他丁對新生豬體外循環(huán)缺血/再灌注后90 min肺泡灌洗液中PMN計數(shù)兩組肺泡灌洗液PMN基礎(chǔ)值差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，再灌注90 min兩組均上升，但實驗組明顯低于對照組，P＜0.05，見 Fig 2。

2.3烏司他丁對新生豬體外循環(huán)肺靜脈血IL-6和TNF-α含量的影響兩組新生豬肺靜脈血漿IL-6和TNF-α含量基礎(chǔ)值差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。T2時點組間比較，實驗組IL-6和TNF-α含量明顯低于對照組，P＜0.05，見Fig 3。

Fig 2 PMN in BALF of two groups

Fig 3 IL-6 and TNF-α of two groups(±s)

Tab 1 W/D weight of two groups(±s，n=6)

Tab 1 W/D weight of two groups(±s，n=6)

T1:after anesthesia;T2:90 min after declamping.*P ＜0.05 vs between two groups;△P ＜0.05 vs T1 in group.

Time W/D weight Control Test T1 4.8 ±0.3 4.3 ±0.4 T2 7.5 ±0.4△ 5.1 ±0.3*

2.4烏司他丁對新生豬體外循環(huán)肺組織濕干比重(W/D)的影響兩組相比，兩組W/D基礎(chǔ)值差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，實驗組W/D在實驗終點均與對照組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見Tab 1。2.5烏司他丁對新生豬體外循環(huán)缺血/再灌注后90 min AQP1的影響AQP1陽性染色呈現(xiàn)深棕黃色?？梢夾QP1主要分布于肺血管內(nèi)皮和肺泡上皮。與對照組相應時點比較，實驗組在T2時點AQP1染色較濃密，提示表達上調(diào)。應用Image-Pro Plus 6.0分析，實驗組AQP1累計光密度率(IOD率，AQP1累計光密度與視野實質(zhì)累計光密度的比率)在實驗組 T2明顯高于對照組，36.05%vs18.2%，P＜0.05，見 Fig 4。Western blot檢測 AQP1蛋白表達表現(xiàn)出相同的趨勢，實驗組T2 AQP1表達明顯高于對照組T2，P＜0.05，見Fig 5。

Fig 4 Expression of AQP1 by immunohistochemistry(×400)

Fig 5 Western blot analysis(B)for AQP1 expression in pulmonary tissue from pig

3 討論

3.1烏司他丁對新生豬體外循環(huán)肺缺血/再灌注損傷的保護作用肺缺血/再灌注引起的肺損傷是臨床體外循環(huán)術(shù)后最主要的并發(fā)癥之一，其發(fā)病率高達15% ～30%［1］。再灌注后氧供突然增加，機體產(chǎn)生大量過氧化產(chǎn)物;同時更多的炎性介質(zhì)、細胞因子在原來體外循環(huán)本身引起的炎性反應的基礎(chǔ)上進入循環(huán)，引起嚴重的正反饋性全身性炎癥反應，導致器官損傷［9］。未成熟肺臟容量小;功能殘氣量(FRC)相對較少;肺泡/體表面積比明顯小于成人;肺血管內(nèi)皮通透性較高，存在通氣/血流比失調(diào)和肺內(nèi)分流;肺表面活性物質(zhì)合成及儲備較低［10］，這些生理特點使其在體外循環(huán)期間更易于受到損傷［2］。絲氨酸蛋白酶抑制劑烏司他丁是一種內(nèi)源性抗侵襲物質(zhì)，可抑制炎癥級聯(lián)反應的多個環(huán)節(jié)，具有防治肺損傷的功效［11］。本實驗對照組中，反映肺組織損傷的HE染色觀察結(jié)果，反映肺組織白細胞浸潤的肺泡灌洗液中PMN計數(shù)、炎癥級聯(lián)反應中的主要炎性介質(zhì)TNF-α、反應組織損傷程度的敏感指標IL-6和肺組織含水指標W/D在實驗結(jié)束時明顯增加，表明體外循環(huán)新生豬發(fā)生了缺血/再灌注損傷。給予烏司他丁可以明顯改善上述指標，說明烏司他丁有效抑制了體外循環(huán)肺缺血/再灌注損傷引起的肺通透性增強、肺水腫形成和白細胞浸潤，具有一定的肺保護作用，與其他研究結(jié)果［10］相符。

3.2AQP1與新生豬體外循環(huán)肺缺血/再灌注早期損傷AQPs又稱水孔蛋白，是細胞膜上一種與水的通透性有關(guān)的轉(zhuǎn)運蛋白。自從1991年被發(fā)現(xiàn)［12］，迄今為止共有200余種 AQPs在不同物種中被發(fā)現(xiàn)。肺內(nèi)AQP1主要分布于肺血管內(nèi)皮。AQP1減輕急性肺損傷中的通透性肺水腫［5－6］，AQP1敲除小鼠肺血管內(nèi)皮通透性降低10倍，從而導致嚴重肺水腫［13］。皮質(zhì)類固醇可促進AQP1表達，從而減輕肺水腫［14］。AQP1是否參與體外循環(huán)肺缺血/再灌注損傷以及烏司他丁肺保護作用是否與AQP1有關(guān)均未見報道。

我們在豬體外循環(huán)中發(fā)現(xiàn)，對照組AQP1蛋白表達在實驗結(jié)束時明顯升高，表明在再灌注期有AQP1合成過程，提示AQP1參與了體外循環(huán)肺缺血/再灌注早期損傷的機體自身的保護過程。在實驗組中給予烏司他丁，AQP1的表達較對照組明顯增高，下游的IL-6和 TNF-α也較對照組降低。提示烏司他丁不僅具有體外循環(huán)肺缺血/再灌注損傷保護作用，而且其可能的機制是通過促進AQP1合成實現(xiàn)的。

由于大動物模型的限制，本實驗不能通過阻斷途徑反向驗證AQP1在體外循環(huán)肺缺血/再灌注損傷中的確切機制。雖然APQ1與AQP5在肺泡腔與毛細血管之間水分子的運轉(zhuǎn)具有同等重要的作用，但AQP5主要分布于肺泡I型細胞上不易鑒別，并且有研究表明在新生鼠中AQP5表達非常低微［15］，因此本實驗未對AQP5進行探討。

3.3烏司他丁的肺保護作用模型探討雖然眾多研究均顯示烏司他丁具有肺保護作用，但在體外循環(huán)肺缺血/再灌注早期損傷中的作用未見報道。大部分研究關(guān)注于烏司他丁對體外循環(huán)本身引起的全身炎性反應中肺部表現(xiàn)的保護。由于體外循環(huán)肺缺血/再灌注損傷，屬于不完全性肺缺血/再灌注損傷［16］，因此其導致的肺損傷不能等同于體外循環(huán)本身引起的肺部損傷。因此本實驗選擇主動脈開放前通過肺動脈注射烏司他丁。實驗結(jié)果提示此種方法具有肺缺血/再灌注損傷保護作用。

3.4小結(jié)烏司他丁對新生豬體外循環(huán)缺血/再灌注導致的肺損傷具有一定的保護作用，可能的作用機制與其促進AQP1合成有關(guān)。提示未來可針對AQP1阻斷途徑進行進一步探討。

［1］Apostolakis E，F(xiàn)ilos K S，Koletsis E，Dougenis D.Lung dysfunction following cardiopulmonary bypass［J］.J Card Surg，2010，25(1):47－55.

［2］Mills A N，Haworth S G.Greater permeability of the neonatal lung.Postnatal changes in surface charge and biochemistry of porcine pulmonary capillary endothelium［J］.J Thorac Cardiovasc Surg，1991，101(5):909 －16.

［3］李秀江，杜玉君，董均樹，等.烏司他丁對內(nèi)毒素誘導的臟器損傷的保護作用［J］.中國藥理學通報，2006，22(11):1387 －9.

［3］Li X J，Du Y J，Dong J S，et al.Protective effects of ulinastatin on injury of organs induced by endotoxin［J］.Chin Pharmacol Bull，2006，22(11):1387 －9.

［4］Nielsen S，King L S，Christensen B M，Agre P.Aquaporins in complex tissuesⅡsubcellular distribution in respiratory and glandular tissues of rat［J］.Am J Physiol，1997，273(5 pt 1):1549 －61.

［5］Towne J E，Harrod K S，Krane C M，et al.Decreased expression of aquaporin(AQP)1 and AQP5 in mouse lung after acute viral infection［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2000，22(1):34 － 44.

［6］Jiao G，Li E，Yu R.Decreased expression of AQP1 and AQP5 in acute injured lungs in rats［J］.Chin Med J(Engl)，2002，115:963－7.

［7］Song Y，Ma T，Matthay M A，Verkman A S.Role of aquaporin-4 in airspace-to-capillary water permeability in intact mouse lung measured by a novel gravimetric method［J］.J Gen Physiol，2000，115(1):17 －27.

［8］King J，Deboisblanc B P，Mason C M，et al.Effect of granulocyte colony-stimulating factor on acure lung injury in the rat［J］.Am J Respir Crit Care Med，1995，151(2 Pt 1):302－9.

［9］榮 健，葉 升，江 楠，等.七氟醚后處理下調(diào)RAGE抑制犬體外循環(huán)肺缺血/再灌注損傷［J］.中國藥理學通報，2010，26(6):723－26.

［9］Rong J，Ye S，Jiang N，et al.Sevoflurane postconditioning protects the lung against ischemia-reperfusion injury with CPB by downregulating RAGE［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(6):723－6.

［10］吳瑞萍，諸福棠.實用兒科學［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1996:85－ 97，1101－15.

［10］Wu R P，Zhu F T.Practical Pediatrics［M］.Beijing:People’s Medical Publishing House，1996:85 －97，1101 －15.

［11］Nakanishi K，Takeda S，Sakamoto A，Kitamura A.Effects of ulinastatin treatment on the cardiopulmonary bypass-induced hemodynamic instability and pulmonary dysfunction［J］.Critical Care Med，2006，34(5):1351 －7.

［12］Preston G M，Agre P.Isolation of the cDNA for erythrocyte integral membrane protein of 28 kilodaltons:member of an ancient channel family［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1991，88(24):11110－4.

［13］Bai C，F(xiàn)ukuda N，Song Y，et al.Lung fluid transport in aquaporin-1 and aquaporin-4 knockout mice［J］.J Clin Invest，1999，103(4):555－61.

［14］King L S，Nielsen S，Agre P.Aquaporin-1 water channel protein in lung:ontogeny，steroid-induced expression，and distribution in rat［J］.J Clin Invest，1996，97(10):2183 － 91.

［15］Ruddy M K，Drazen J M，Pitkanen O M，et al.Modulation of aquaporin 4 and the amiloride-inhibitable sodium channel in perinatal rat lung epithelial cells［J］.Am J Physiol，1998，274(6 Pt 1):L1066－72.

［16］Schlensak C，Doenst T，Preusser S，et al.Cardiopulmonary bypass reduction of bronchial blood flow:A potential mechanism for lung injury in a neonatal pig model［J］.J Thor Cardiovascul Surg，2002，123:1199 －205.