祁 歡，薛永志，洪高明

(1.包頭醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，內(nèi)蒙古包頭 014060;2.包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，內(nèi)蒙古包頭 014010)

子宮肌瘤是子宮平滑肌細(xì)胞過(guò)度增殖的性激素依賴性疾病，其生長(zhǎng)和退化在細(xì)胞以及分子水平上的機(jī)制仍未闡明［1］。血管新生參與腫瘤及多種疾病的病理過(guò)程，而子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展也極大地依賴血管新生的作用。全反式維A酸(ATRA)作為經(jīng)典的細(xì)胞誘導(dǎo)分化劑，促進(jìn)細(xì)胞分化，抑制腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的血管新生［2］，可對(duì)子宮肌瘤的發(fā)病過(guò)程有影響。一氧化氮(NO)參與血管擴(kuò)張、血管通透性、血小板黏附和聚集等，也參與子宮肌瘤的病理過(guò)程［4］。探討活性氧自由基NO與腫瘤的關(guān)系是近年來(lái)腫瘤病因?qū)W研究的一個(gè)熱點(diǎn)，而國(guó)內(nèi)外有關(guān)RA對(duì)雌、孕激素負(fù)荷法建立的大鼠子宮肌瘤中NOS的影響的報(bào)道尚不多見。本研究以雌、孕激素負(fù)荷法建立大鼠子宮肌瘤模型［5］，觀察應(yīng)用ATRA前后子宮外觀及鏡下改變，以及RARα、iNOS的表達(dá)情況，深入探討ATRA在子宮肌瘤過(guò)程中的作用及其作用環(huán)節(jié)，為子宮肌瘤的藥物治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑清潔級(jí)♀Wistar大鼠60只，體質(zhì)量(170±10)g，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(蒙)2002-0001，購(gòu)自內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。苯甲酸雌二醇(estradiol benzoate，E2)注射液，天津金耀氨基酸有限公司，1 g·L－1，批號(hào):H12020529;黃體酮(progesterone，P)注射液，20 g·L－1，上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號(hào):H33020828;ATRA標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自鄭州荔諾生物科技有限公司;兔抗大鼠RARα多克隆抗體、兔抗大鼠iNOS多克隆抗體，即用型SABC免疫組化試劑盒，DAB顯色劑均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2主要儀器Sartorius BS210S電子天平，德國(guó)Sartorius公司;CX41RF奧林帕斯顯微鏡;形態(tài)分析系統(tǒng)，江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司。

1.3動(dòng)物分組及建模方法Wistar大鼠60只，經(jīng)1周的喂養(yǎng)適應(yīng)后，隨機(jī)分為5組，每組12只，A組(對(duì)照組)，給予NS，劑量、時(shí)間等均與雌孕激素給藥情況相同;B組(模型組)，給予苯甲酸雌二醇注射液(0.59 mg·kg－1·d－1，wk1 ～ 12，im)、黃體酮注射液(5.9 mg·kg－1·wk－1，wk1 ～ 12，im);C 組(ATRA低劑量組)，給予雌孕激素給藥情況同B組，于第 10周起給予 ATRA(0.25 mg·d－1，d1～14，ip);D組(ATRA中劑量組)雌孕激素給藥情況同B組，于第10周起給予 ATRA(0.5 mg·d－1，d1～14，ip);E組(ATRA高劑量組)雌孕激素給藥情況同 B 組，于第10 周起 ATRA(1 mg·d－1，d1 ～14，ip)。第12周末處死所有大鼠，剪取子宮使之離體、拍照，電子分析天平稱取子宮濕重(g)，計(jì)算子宮系數(shù)(子宮重量:大鼠體質(zhì)量mg·g－1)，游標(biāo)卡尺測(cè)量左、右宮角長(zhǎng)度(mm)、宮角最大直徑(mm)、宮頸長(zhǎng)度(mm)、宮頸寬度(mm)。4%多聚甲醛溶液固定子宮標(biāo)本，取子宮分角以上0.5 cm相同部位一段子宮，石蠟包埋、切片、HE染色，光學(xué)生物顯微鏡觀察平滑肌細(xì)胞的病理改變。

Tab 1 Rat uterus wet weight，uterus weight/body weight，various uterus radial line in all groups(±s，n=12)

Tab 1 Rat uterus wet weight，uterus weight/body weight，various uterus radial line in all groups(±s，n=12)

A:Control;B:Model;C:ATRA low-dose;D:ATRA mid-dose;E:ATRA high-dose.＊＊P＜0.01 vs A group;#P＜0.05 vs B group

Group Uterus wetwt/g Uterus/%of body weight Left uterus horn/mm Right uterus horn/mm Uteru s horn max dia/mm Cervix length/mm A 0.36 ±0.06 1.41 ±0.09 21.94 ±2.57 17.77 ±2.353.39 ±0.47 3.16 ±0.55 B 4.11 ±0.48＊＊ 15.39 ±0.96＊＊ 46.34 ±9.57＊＊ 39.86 ±9.21＊＊ 8.14 ±1.08＊＊ 6.24 ±0.82＊＊C 2.51 ±0.15# 8.33 ±0.85# 31.24 ±5.76# 27.43 ±5.01# 5.60 ±0.65# 3.61 ±0.72#D 3.07 ±0.65# 7.89 ±0.95# 26.55 ±4.02# 22.77 ±3.17# 5.33 ±0.58# 2.95 ±0.46#E 3.45 ±0.61# 6.12 ±0.69# 24.35 ±3.78# 21.55 ±3.52# 5.34 ±0.76# 2.94 ±0.58#

1.4免疫組化法測(cè)定RARα、iNOS的表達(dá)采用免疫組化ABC法分別測(cè)定RARα、iNOS在各組大鼠子宮肌層中的表達(dá)情況，具體步驟按試劑盒說(shuō)明書方法操作，一抗稀釋倍數(shù)為1∶100。每張切片選擇染色良好區(qū)域，隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野。RARα、iNOS均以細(xì)胞染成棕黃色為陽(yáng)性，采用形態(tài)分析系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞率，細(xì)胞陽(yáng)性率以高倍鏡下每視野光密度值(OD)來(lái)表示。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，單因素方差分析進(jìn)行組間比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用±s表示。

2 結(jié)果

2.1ATRA對(duì)各組大鼠子宮濕重、子宮系數(shù)、子宮各徑線的影響經(jīng)過(guò)12周雌孕激素負(fù)荷刺激，B組大鼠子宮濕重，子宮系數(shù)及各徑線值明顯增加(P＜0.01);而C、D、E三組大鼠子宮濕重，子宮系數(shù)及各徑線值均小于B組(P＜0.05)，而這種作用在給藥組間差異并未呈顯著性(P＞0.05)，見Tab 1。

2.2造模、給藥后各組大鼠子宮大體外觀改變，及鏡下病理組織學(xué)特征正常對(duì)照組大鼠子宮質(zhì)地均勻，色澤鮮亮粉紅，未見結(jié)節(jié)、囊腫及腫脹。雌、孕激素負(fù)荷造模后，子宮色澤晦暗，明顯腫脹，甚至可見宮角局部腫塊;而ATRA給藥3組中大鼠子宮外觀都有所改變，尤其在中、高劑量組中子宮色澤明顯鮮亮，表面光滑，宮體明顯縮小(Fig 1)。

HE染色顯示，正常對(duì)照組大鼠子宮平滑肌層較薄，平滑肌細(xì)胞細(xì)長(zhǎng)，排列整齊，呈梭形，細(xì)胞核桿狀，核仁不清，有少許嗜酸性細(xì)胞，偶見淋巴細(xì)胞。模型組大鼠子宮平滑肌出現(xiàn)多發(fā)性、局灶性增生，局部平滑肌增厚，細(xì)胞明顯粗大、增粗，肌纖維增粗，排列紊亂，有的肌層細(xì)胞縱橫交錯(cuò)，呈柵欄狀改變;細(xì)胞核增大，呈短梭形或橢圓形，核仁清晰，結(jié)締組織增生明顯。ATRA治療組大鼠子宮平滑肌局灶性增生區(qū)域明顯減少，核以梭形、桿狀居多，少數(shù)呈橢圓形，核仁不清，大部分平滑肌層略厚，肌細(xì)胞排列較整齊(Fig 2)。

2.3RARα的表達(dá)情況與ATRA治療之間的關(guān)系光鏡下，大鼠子宮組織RARα的陽(yáng)性細(xì)胞呈明顯的棕黃色，分布于細(xì)胞核中，表達(dá)強(qiáng)度不一。A組幾乎看不到表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞，而在其它4組中表達(dá)RARα陽(yáng)性的細(xì)胞滿視野清晰可見(如Fig 3)。與A組相比，B組的RARα細(xì)胞陽(yáng)性率明顯增高(P＜0.05)，與B組相比，C、D、E 3組的 RARα細(xì)胞陽(yáng)性率差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見Tab 2。

2.4ATRA對(duì)大鼠子宮組織內(nèi)iNOS表達(dá)的影響光鏡下，大鼠子宮組織iNOS的陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色，弱表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，各組的表達(dá)強(qiáng)度不一，A組中幾乎看不到棕黃色染色細(xì)胞，而B組卻清晰可見，而D、E組的細(xì)胞染色狀況與對(duì)照組幾乎完全相同(如Fig 4)。形態(tài)分析系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的比率，與A相比，B組iNOS的陽(yáng)性表達(dá)率明顯增加(P＜0.05)，與B組相比，C組陽(yáng)性表達(dá)率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而D、E組的陽(yáng)性表達(dá)率則明顯降低(P＜0.05)，但二者之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見Tab 2。

Tab 2 Number of RARα and iNOS positive cells/high-power field in all groups(±s，n=12)

Tab 2 Number of RARα and iNOS positive cells/high-power field in all groups(±s，n=12)

*P＜0.05 vs A group;#P＜0.05 vs B group

Group RARα/S × OD μm2/view iNOS/S × OD μm2/view A 56.2 ±5.0 104.5 ±14.8 B 68 554.6 ±5 232.7* 4 421.8 ±466.5*C 75 545.2 ±8 227.5* 5 858.4 ±627.5 D 63 690.4 ±6 858.2* 232.6 ±36.2#E 71 564.3 ±6 352.3* 133.1 ±15.4#

Fig 1 Alteration of uterine appearance in each group Fig 2 Pathological features in uterus by HE in each group(HE strains，×200)Fig 3 Immunohistochemistry of RARα expression in rat uterus(immunohistochemistry strains，×400)Fig 4 Immunohistochemistry of iNOS expression in rat uterus(immunohistochemistry strains，×400)

3 討論

在以往的大鼠子宮肌瘤造模試驗(yàn)中激素的給藥時(shí)間均大于20周，雌、孕激素的給藥量也均小于本試驗(yàn)的給藥量，所以在縮小給藥時(shí)間加大給藥劑量的新情況下同樣可以成功建立子宮肌瘤模型，這一結(jié)果與Minnie Malik等的研究結(jié)果相吻合［6］。Wil Catherino等［3］通過(guò)高效液相色譜證實(shí)在與正常子宮肌層相比較時(shí)，肌瘤組織中ATRA及9-cisRA的表達(dá)下降，這一結(jié)論也更加支持我們應(yīng)用ATRA來(lái)治療子宮肌瘤的設(shè)想。本次研究中發(fā)現(xiàn)雌孕激素刺激后子宮肌瘤組織中RARα和iNOS的表達(dá)明顯增加，RARα的高表達(dá)也正是應(yīng)用ATRA治療的動(dòng)機(jī)所在。平滑肌瘤表型的特性體現(xiàn)在胞外基質(zhì)的過(guò)度分裂，有研究表明分化模式的改變?cè)诟鞣N正常組織中，以及腫瘤組織中均被發(fā)現(xiàn)是受RA所影響［6］。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)平滑肌細(xì)胞的增殖被ATRA所抑制，這種抑制也呈劑量依賴性，并且肌瘤細(xì)胞對(duì)ATRA的敏感性要比肌層細(xì)胞更高［7］，表明RARα在大鼠子宮肌瘤模型中高表達(dá)，這說(shuō)明這些腫瘤也都有潛在的RA治療的有效性，而我們所得出的結(jié)果也正是證實(shí)了這一推斷。

近年大量研究資料顯示多種婦科腫瘤組織中同樣存在iNOS高表達(dá)，表明NOS在許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。本研究運(yùn)用免疫組化技術(shù)顯示iNOS在子宮肌瘤組織中的表達(dá)高于正常子宮平滑肌組織，我們得到的結(jié)果表明iNOS的過(guò)表達(dá)與子宮肌瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程有關(guān)，它們可能在子宮肌瘤的發(fā)病機(jī)制中起一定作用，如參與肌瘤細(xì)胞的增殖與分化，但NO和NOS究竟是通過(guò)哪條途徑促進(jìn)子宮肌瘤的發(fā)生、發(fā)展，還有待于進(jìn)一步探討。在ATRA組內(nèi)，其表達(dá)的陽(yáng)性率比模型組明顯降低，說(shuō)明ATRA有抑制iNOS產(chǎn)生的作用，進(jìn)而發(fā)揮其抗腫瘤保護(hù)子宮平滑肌的作用。而ATRA發(fā)揮作用是需要通過(guò)其受體RARα。iNOS是通過(guò)誘生催化左旋精氨酸上的胍基氮，來(lái)誘生產(chǎn)生大量NO，強(qiáng)烈舒張血管，增加血流量，也是維持腫瘤生長(zhǎng)的必須條件。多項(xiàng)研究證實(shí)，維A酸能抑制血管生成因子活性，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及遷移，誘導(dǎo)血管生成因素如內(nèi)皮抑素、血管抑素的產(chǎn)生［8］。NO又可產(chǎn)生氮氧自由基和大量亞硝酸鹽引發(fā)組織產(chǎn)生氧化/硝化應(yīng)激，激活核轉(zhuǎn)錄，引發(fā)大量細(xì)胞因子產(chǎn)生［9］，這極有可能參與肌瘤的發(fā)生發(fā)展。關(guān)于ATRA如何降低iNOS陽(yáng)性表達(dá)率的機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步深入研究。

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