閆彩珍，于 亮，劉 川，郝曉玲，王天魁

(河北醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，河北石家莊 050017)

阿片類(lèi)藥物成癮的主要特征表現(xiàn)為強(qiáng)迫性和持續(xù)性藥物使用。目前研究認(rèn)為藥物成癮行為的持久存在，可能與轉(zhuǎn)錄因子短暫調(diào)節(jié)所致的突觸結(jié)構(gòu)及相關(guān)神經(jīng)回路的結(jié)構(gòu)重塑有關(guān)［1］。成癮藥物所致持續(xù)性結(jié)構(gòu)改變的一個(gè)備受關(guān)注的例子是，反復(fù)使用成癮藥物可引起與情感動(dòng)機(jī)、獎(jiǎng)賞和學(xué)習(xí)有關(guān)腦區(qū)神經(jīng)元樹(shù)突棘的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生持久改變［2］，提示突觸聯(lián)系發(fā)生了可塑性變化。

樹(shù)突棘是神經(jīng)元之間形成興奮性突觸的位置，它們?cè)谏窠?jīng)元中呈現(xiàn)不同的形狀，目前已證實(shí)樹(shù)突棘形態(tài)動(dòng)力學(xué)是由肌動(dòng)蛋白動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的，肌動(dòng)蛋白在棘突形態(tài)形成中發(fā)揮重要作用［3］。肌動(dòng)蛋白是真核細(xì)胞最主要的骨架成份之一，它以單體(G-actin)和纖維狀(F-actin)兩種形式存在，并且單體與纖維狀肌動(dòng)蛋白之間可以相互轉(zhuǎn)換。在神經(jīng)元樹(shù)突棘可以觀(guān)察到與肌動(dòng)蛋白有關(guān)的運(yùn)動(dòng)性，熒光漂白恢復(fù)技術(shù)分析顯示樹(shù)突棘F(xiàn)-actin可以發(fā)生快速的循環(huán)。藥理學(xué)研究顯示，控制肌動(dòng)蛋白循環(huán)可以導(dǎo)致樹(shù)突棘發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，提示肌動(dòng)蛋白在調(diào)節(jié)神經(jīng)元樹(shù)突棘的形態(tài)和動(dòng)力學(xué)中發(fā)揮重要作用［4］。研究顯示，長(zhǎng)期嗎啡處理可增加伏隔核F-actin的含量［5］，條件性位置厭惡大鼠杏仁核和背側(cè)海馬肌動(dòng)蛋白發(fā)生重構(gòu)［6］，但是對(duì)嗎啡依賴(lài)不同時(shí)程大鼠不同腦區(qū)肌動(dòng)蛋白的重構(gòu)并不清楚，同時(shí)嗎啡影響細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白表達(dá)及重構(gòu)的分子機(jī)制也尚未闡明。

本研究擬從影響神經(jīng)元形態(tài)和功能的骨架肌動(dòng)蛋白入手，采用動(dòng)物行為學(xué)、Western blot等方法，研究嗎啡依賴(lài)大鼠部分腦區(qū)肌動(dòng)蛋白及其結(jié)合蛋白p-cofilin的表達(dá)變化，探討骨架肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白在嗎啡誘導(dǎo)的神經(jīng)元突觸可塑中的作用，進(jìn)一步深化阿片類(lèi)藥物成癮的分子生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物♂ Sprauge Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2藥物及試劑鹽酸嗎啡注射液購(gòu)自沈陽(yáng)第一制藥廠(chǎng);鹽酸納洛酮注射液購(gòu)自北京華素制藥股份有限公司;Actin抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;pcofilin抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司;BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)PIERCE公司;辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗小鼠、羊抗兔抗體購(gòu)自美國(guó)KPL公司;DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.1.3主要儀器5417R型低溫離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司;超高速離心機(jī)，美國(guó) Beckman公司;AG135型電子天平，瑞士Mettler Toledo公司;1004型恒溫水浴箱，德國(guó)GFL公司;SHY-200B型水平搖床，德國(guó)Leica公司;Millipore純水儀，美國(guó)Millipore公司;DYY-11型多用電泳儀、DYC-Z22A型電泳槽，北京六一儀器廠(chǎng);凝膠成像儀，美國(guó)Themo Foma公司。

1.2 方法

1.2.1大鼠嗎啡依賴(lài)模型建立♂ SD大鼠42只，隨機(jī)分為嗎啡依賴(lài)1周組、嗎啡依賴(lài)2周組和嗎啡依賴(lài)4周組，各依賴(lài)組均設(shè)對(duì)照。每組7只大鼠，分籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水，動(dòng)物適應(yīng)新環(huán)境3 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用腹腔遞增注射鹽酸嗎啡建立嗎啡依賴(lài)模型，連續(xù)注射7 d，每天3次，劑量按5，10，15，20，30，40，50 mg·kg－1逐日遞增，對(duì)照組給予同體積生理鹽水。d 8，在各組大鼠中每組隨機(jī)選取2只，于嗎啡注射前2 h皮下注射鹽酸納洛酮5 mg·kg－1，觀(guān)察戒斷癥狀，并進(jìn)行評(píng)分，判斷大鼠嗎啡依賴(lài)模型是否建立成功。然后將嗎啡依賴(lài)1周組與對(duì)照組大鼠斷頭處死，分離相關(guān)腦區(qū)。嗎啡依賴(lài)2周組、4周組繼續(xù)分別給予50 mg·kg－1鹽酸嗎啡，每天1次，連續(xù)注射1或3周。在最后一次給藥后5 h斷頭處死大鼠，迅速分離前額葉皮層、丘腦、海馬及紋狀體，置液氮快速冷凍后轉(zhuǎn)移至－80℃冰箱保存。

1.2.2戒斷癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［7］① 跳躍、濕狗樣抖動(dòng)、扭體、搖頭、打哈欠、掃尾:0分=無(wú);1分=1～5次;2分=6～10次;3分 ＞10次。② 齒顫、咀嚼(次與次之間至少間隔30 s):0分=無(wú);1分=1～10次;2分=11～20次;3分＞20次。③ 流涎、流淚、豎毛、眼瞼下垂、激惹和腹瀉:0分=無(wú);1分=輕度;2分=中度;3分=明顯。

1.2.3腦組織總蛋白的制備腦組織按每100 mg組織加入1 ml的組織蛋白裂解液(50 mmol·L－1Tris-Cl，pH 7.4，150 mmol·L－1NaCl，1 mmol·L－1EGTA，1 mmol·L－1EDTA，1%NP40，1 mmol·L－1DTT，1 mmol·L－1PMSF，1 mg·L－1aprotintin，1 mg·L－1pepstatin A，1 mg·L－1leupeptin)，在 DY-89Ⅰ型電動(dòng)勻漿器下勻漿30 s，4℃ 12 000 r·min－1離心20 min，收集上清，其中包含p-cofilin蛋白成分。

1.2.4蛋白分步提取和Western印跡分析根據(jù)G-actin屬于胞質(zhì)可溶性蛋白，F(xiàn)-actin為細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，采用不同緩沖液對(duì)這兩種蛋白進(jìn)行分部提取。腦組織按每100 mg組織加入1 ml的組織蛋白裂解液(20 mmol·L－1Tris-Cl，pH 7.5，1 mmol·L－1Na3VO4，1%Triton X-100，5 mmol·L－1EGTA，1 mmol·L－1PMSF，1 mg·L－1aprotintin，1 mg·L－1pepstatin A，1 mg·L－1leupeptin)，在 DY-89Ⅰ型電動(dòng)勻漿器下勻漿30 s，冰浴30 min裂解后，4℃12 000 r·min－1離心30 min后取上清，即為G-actin的蛋白組分(含肌動(dòng)蛋白單體G-actin)。沉淀按100 mg加入1 ml裂解液的比例重懸于緩沖液(10 mmol·L－1Tris-Cl，pH 7.5，150 mmol·L－1NaCl，1%Triton X-100，0.1%SDS，1 mmol·L－1脫氧膽酸鈉，2 mmol·L－1EDTA，1 mmol·L－1PMSF，1 mg·L－1aprotintin，1 mg·L－1pepstatin A，1 mg·L－1leupeptin)中冰浴30 min，間斷渦旋混勻，4℃ 12 000 r·min－1離心30 min后取上清，即為F-actin的蛋白組分［8］。BCA法蛋白定量，各取等量 G-actin組分及相應(yīng)體積的F-actin組分，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上(4 ℃，2h)，50 g·L－1脫脂奶粉的TBST封閉1 h，分別加入小鼠β-actin單克隆抗體(1∶500)、兔抗GAPDH多克隆抗體(1∶500)，4℃過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次10 min，然后加入相應(yīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(37℃，1h)，DAB顯色。采用凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)Western blot區(qū)帶進(jìn)行定量分析，P-cofilin蛋白的相對(duì)含量用其灰度值與GAPDH的灰度值比值來(lái)表示，肌動(dòng)蛋白重構(gòu)用F-actin/G-actin來(lái)表示。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Origin7.5軟件進(jìn)行圖像處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析，Dunnett檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。

2 結(jié)果

2.1行為學(xué)觀(guān)察大鼠在注射納洛酮30 min后，嗎啡處理大鼠出現(xiàn)明顯的濕狗樣顫抖、吞咽、站立、跳躍、齒顫、上瞼下垂、流涎、腹瀉等戒斷癥狀，對(duì)戒斷癥狀進(jìn)行評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)Tab 1。與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說(shuō)明嗎啡依賴(lài)大鼠模型建立成功。

Tab 1 The withdrawal score in morphine dependent rats of different groups(±s)

Tab 1 The withdrawal score in morphine dependent rats of different groups(±s)

＊＊P ＜0.01 vs control.C:control;M:morphine treatment

Group Withdrawal score 3.1 ±2.4 M 27.8 ±5.6 C＊＊

2.2嗎啡依賴(lài)大鼠前額葉皮質(zhì)中F-actin/G-actin、p-cofilin蛋白表達(dá)的變化與對(duì)照組相比，嗎啡依賴(lài)各組總actin的表達(dá)無(wú)變化，嗎啡依賴(lài)1周組大鼠前額葉皮質(zhì)內(nèi)F-actin/G-actin的比值沒(méi)有變化，嗎啡依賴(lài)2周組和4周組大鼠前額葉皮質(zhì)內(nèi)F-actin/G-actin的比值分別上調(diào)53%(P＜0.05)和102%(P＜0.01)。嗎啡依賴(lài)1周組大鼠前額葉皮質(zhì)內(nèi)pcofilin表達(dá)量沒(méi)有變化，嗎啡依賴(lài)2周組和4周組大鼠前額葉皮質(zhì)內(nèi)p-cofilin表達(dá)量分別上調(diào)93%(P＜0.01)和88%(P＜0.01)(Fig 1)。

2.3嗎啡依賴(lài)大鼠海馬中F-actin/G-actin、p-cofilin蛋白表達(dá)的變化與對(duì)照組相比，嗎啡依賴(lài)1周組和2周組大鼠海馬中F-actin/G-actin的比值沒(méi)有變化，嗎啡依賴(lài)4周組海馬中F-actin/G-actin比值上調(diào)94%(P＜0.01)。嗎啡依賴(lài)1周組大鼠海馬中p-cofilin蛋白表達(dá)量沒(méi)有變化，嗎啡依賴(lài)2周組和4周組大鼠海馬中p-cofilin蛋白表達(dá)量分別上調(diào)45%(P＜0.05)和30%(P＜0.05)(Fig 2)。

2.4嗎啡依賴(lài)大鼠紋狀體中F-actin/G-actin、pcofilin蛋白表達(dá)的變化與對(duì)照組相比，嗎啡依賴(lài)各組大鼠紋狀體內(nèi)F-actin/G-actin比值沒(méi)有變化。嗎啡依賴(lài)1周組大鼠紋狀體內(nèi)p-cofilin蛋白表達(dá)量沒(méi)有變化，嗎啡依賴(lài)2周組和4周組的大鼠紋狀體內(nèi)p-cofilin的蛋白表達(dá)量分別下調(diào)25%(P＜0.05)和30%(P＜0.05)(Fig 3)。

Fig 1 Expressions of F-actin/G-actin and p-cofilin in prefrontal cortex of morphine dependent rats(±s，n=5)

Fig 2 Expressions of F-actin/G-actin and p-cofilin in hippocampus of morphine dependent rats(±s，n=5)

Fig 3 Expressions of F-actin/G-actin and p-cofilin in striatum of morphine dependent rats(±s，n=5)

2.5嗎啡依賴(lài)1、2和4周組大鼠丘腦中均未發(fā)現(xiàn)F-actin/G-actin、p-cofilin蛋白表達(dá)量發(fā)生明顯變化

3 討論

嗎啡濫用可造成神經(jīng)系統(tǒng)突觸的可塑性改變，以往的研究表明［9－10］，突觸可塑性包括很多環(huán)節(jié)，其中樹(shù)突棘的形態(tài)學(xué)改變被認(rèn)為是促成各種刺激事件誘導(dǎo)的行為適應(yīng)性改變的重要基礎(chǔ)，各種的刺激性事件就包括嗎啡成癮。這樣，嗎啡等精神藥物誘導(dǎo)的動(dòng)物模型所表現(xiàn)出來(lái)的行為的可塑性與成癮性被聯(lián)系到樹(shù)突蛋白的持續(xù)性適應(yīng)性改變，現(xiàn)在的研究認(rèn)為樹(shù)突棘的形態(tài)學(xué)改變與其骨架肌動(dòng)蛋白的重構(gòu)有密切關(guān)系。肌動(dòng)蛋白以單體和多聚體兩種表型存在，單體的肌動(dòng)蛋白是由一條多肽鏈構(gòu)成的球形分子，又稱(chēng)球狀肌動(dòng)蛋白(G-actin)，肌動(dòng)蛋白的多聚體形成肌動(dòng)蛋白絲，稱(chēng)為纖維狀肌動(dòng)蛋白(F-actin)。肌動(dòng)蛋白作為一種動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，持續(xù)進(jìn)行組裝和解聚，而體內(nèi)肌動(dòng)蛋白的裝配及在細(xì)胞中的特性受肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白及上游信號(hào)分子的調(diào)節(jié)［3］。

Cofilin是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，Cofilin通過(guò)切斷F-actin，增加F-actin末端肌動(dòng)蛋白亞單位的解離速度來(lái)調(diào)節(jié)其動(dòng)力學(xué)［11］。Cofilin的活性依賴(lài)于它的磷酸化狀態(tài)，其受各種激酶及RhoGTPases的調(diào)節(jié)。RhoGTPase可通過(guò) PAK、ROCK2/LIMK通路使cofilin磷酸化而降低其活性［12－13］。NMDA 受體激活后可以通過(guò) NMDA/Ca2+/calcineurin/SSH通路使cofilin脫磷酸化而激活［14－15］。除了受磷酸化的調(diào)節(jié)之外，cofilin還與其它肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白發(fā)生相互作用，共同調(diào)節(jié)棘突的穩(wěn)定性［16］。以上的研究提示，cofilin在樹(shù)突棘可塑性中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。然而p-cofilin在嗎啡依賴(lài)形成過(guò)程中的變化，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。

本研究通過(guò)建立大鼠嗎啡依賴(lài)模型，選擇與嗎啡依賴(lài)關(guān)系密切的腦區(qū):海馬、前額葉皮質(zhì)、丘腦以及紋狀體，測(cè)定了嗎啡依賴(lài)狀態(tài)下F-actin、G-actin、p-cofilin在上述腦區(qū)的表達(dá)變化。研究結(jié)果顯示，在慢性嗎啡處理2周和4周大鼠的前額葉皮質(zhì)以及嗎啡處理4周的海馬中F-actin/G-actin的比值均出現(xiàn)明顯上調(diào)。F-actin/G-actin比值的變化提示肌動(dòng)蛋白骨架出現(xiàn)了重構(gòu)，但是嗎啡依賴(lài)不同時(shí)程其變化不同，不同的腦區(qū)其變化亦不相同。

本研究顯示，肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白p-cofilin在嗎啡處理2周和4周的海馬和額葉皮質(zhì)中均出現(xiàn)了表達(dá)上調(diào)，與F-actin的表達(dá)量增加相一致，提示嗎啡誘導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白重構(gòu)可能與cofilin的磷酸化狀態(tài)有關(guān)。但p-cofilin在紋狀體中的表達(dá)卻減少了，提示不同的腦區(qū)可能存在著不同的調(diào)節(jié)機(jī)制。Cofilin的活性可影響神經(jīng)元特異性肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白drebrin與F-actin的結(jié)合，進(jìn)而影響棘突肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性［16］，而drebrin的異?？捎绊懲挥|可塑性，導(dǎo)致機(jī)體不同程度的認(rèn)知障礙［17］。行為學(xué)的研究表明cofilin與認(rèn)知功能存在密切聯(lián)系［18］，在阿爾采末病病人大腦的額皮質(zhì)和海馬中，發(fā)現(xiàn)異常的cofilin-actin的棒狀結(jié)構(gòu)。由于應(yīng)激誘導(dǎo)的這種棒狀結(jié)構(gòu)在軸突和樹(shù)突的形成，能夠?qū)е律窠?jīng)性變性疾病［19］。在嗎啡成癮過(guò)程中均伴有不同程度的認(rèn)知和行為障礙，提示p-cofilin嗎啡依賴(lài)誘導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白重構(gòu)過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用，但其上游信號(hào)調(diào)節(jié)過(guò)程還有待于進(jìn)一步研究。

總之，我們的研究首次證明，大鼠嗎啡依賴(lài)時(shí)，伴隨著腦組織中肌動(dòng)蛋白水平的變化，提示嗎啡依賴(lài)時(shí)大鼠腦組織中肌動(dòng)蛋白發(fā)生了重構(gòu)，肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白p-cofilin在嗎啡誘導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白重構(gòu)中可能發(fā)揮重要作用。我們的結(jié)果對(duì)進(jìn)一步闡明嗎啡成癮的細(xì)胞及分子生物學(xué)機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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