翟羽佳，陳邦添，李善兵，李怡芳，謝 果，何蓉蓉，栗原博

(暨南大學(xué)中藥及天然藥物研究所，廣東廣州 510632)

由于高脂血癥可誘發(fā)心腦血管等多種相關(guān)疾病，因此人們十分關(guān)注對(duì)其治療藥物的研發(fā)和藥效評(píng)價(jià)方法的建立。表面活性劑Triton WR-1339(tyloxapol)誘發(fā)動(dòng)物高脂血癥模型，具有操作簡(jiǎn)便且藥效評(píng)價(jià)快速等特點(diǎn)而被廣泛運(yùn)用。本實(shí)驗(yàn)從基因水平探討Triton WR-1339誘發(fā)高脂血癥的機(jī)制，旨在為該模型用于降血脂藥物篩選和藥效評(píng)價(jià)提供有益的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料7周齡♂清潔級(jí)昆明種小鼠購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào):SCXK(粵)2008-0002。Triton WR-1339購(gòu)自美國(guó) Sigma公司，TC、TG、LDL-C、LPL、HTGL 及考馬斯亮藍(lán)蛋白試劑盒均購(gòu)于南京建成生物科技有限公司(批 號(hào)分 別 為:20100527、20100527、20100517、20100719、20100705)，引物由美國(guó)Invitrogen(上海)英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2Triton WR-1339誘發(fā)小鼠高脂血癥將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組與Triton WR-1339模型組，每組10只。模型組300 mg·kg－1劑量尾靜脈注射Triton WR-1339造模，對(duì)照組注射等量生理鹽水。造模18 h后，小鼠乙醚麻醉下經(jīng)心臟取血并加肝素抗凝，同時(shí)取出小鼠肝臟后冷藏備用。

1.3血漿TG、TC及LDL-C水平測(cè)定全血于4℃，2 000 r·min－1離心10 min分離血漿，按試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血漿TG、TC及LDL-C的水平。

1.4肝組織LPL、HTGL活性及mRNA表達(dá)水平的測(cè)定將肝臟用生理鹽水制成10%的組織勻漿液，3 000 r·min－1離心10 min后，取上清按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定肝組織LPL及HTGL的活性。用TRIzol法提取肝組織總 RNA，取1 μg總RNA合成cDNA后進(jìn)行PCR反應(yīng)。LPL引物序列為(F)5'-CTAACTGCCACTTCAACC-3'和(R)5'-CAGACTTCCTGCTACGC-3'，擴(kuò)增片段320 bp。HTGL引物序列為(F)5'-TGGACGGGAAGAACAAG-3'和(R)5'-GGAGTCAATGAAGAGGTGC-3'，擴(kuò)增片段 326 bp。18S引物序列為(F)5'-GGGAGAGCGGGTAAGAGA-3'和(R)5'-ACAGGACTAGGCGGAACA-3'，擴(kuò)增片段241 bp。取6 μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分離，采用Quantity One圖像分析軟件分析數(shù)據(jù)，以目的條帶與18S的灰度比值進(jìn)行半定量分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s表示，使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析和處理，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1Triton WR-1339對(duì)小鼠血漿TC、TG及LDL-C水平的影響如Tab 1所示，與正常對(duì)照組相比，小鼠尾靜脈注射Triton WR-1339可以升高血漿中TC，TG及LDL-C水平(P＜0.01)。

Tab 1 Effect of Triton WR-1339 on the levels of TC，TG，LDL-C in plasma of mice(±s，n=10)

Tab 1 Effect of Triton WR-1339 on the levels of TC，TG，LDL-C in plasma of mice(±s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs normal control group

＊＊

2.2Triton WR-1339對(duì)小鼠肝中LPL、HTGL活性及mRNA表達(dá)的影響如Tab 2所示，與正常對(duì)照組相比，小鼠尾靜脈注射Triton WR-1339可以降低肝臟組織中LPL、HTGL活性及其mRNA的表達(dá)(P＜0.05，P＜0.01)。

3 討論

表面活性劑Triton WR-1339靜脈負(fù)荷小鼠后血漿TG、TC及LDL-C水平明顯升高［1］，誘發(fā)急性高脂血癥。Schurr等［2］的早期研究提示該模型的產(chǎn)生機(jī)制主要與抑制脂蛋白酶活性有關(guān)，但是對(duì)具體脂蛋白酶活性及基因表達(dá)的研究報(bào)道甚少。LPL與HTGL是兩種重要的脂蛋白酶，可以催化CM和VLDL等血漿脂蛋白中TG分解為脂肪酸和單酸甘油酯，以提供組織氧化和貯存［3－5］。我們的研究結(jié)果顯示，Triton WR-1339負(fù)荷抑制小鼠肝臟組織中LPL及HTGL活性的同時(shí)，也抑制了這些酶的mRNA表達(dá)。本研究結(jié)果表明尾靜脈注射Triton WR-1339誘發(fā)小鼠高脂血癥機(jī)制可能與其抑制LPL、HTGL活性及mRNA表達(dá)相關(guān)，研究結(jié)果為該模型用于降血脂藥物篩選和藥效評(píng)價(jià)提供有益的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

Tab 2 Effect of Triton WR-1339 on the levels and mRNA expressions of LPL and HTGL in liver of mice(±s，n=10)

Tab 2 Effect of Triton WR-1339 on the levels and mRNA expressions of LPL and HTGL in liver of mice(±s，n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs normal control group.

Group LPL/kU·g－1Pro HTGL/kU·g－1Pro LPL/18S HTGL/18S Normal control 2.60 ±0.36 1.42 ±0.16 0.53 ±0.090.45 ±0.11 Triton WR-1339 1.85 ±0.31＊＊ 1.05 ±0.17＊＊ 0.15 ±0.05＊＊ 0.37 ±0.08*

［1］余艷輝，文 軍，郭兆貴.Triton WR-1339對(duì)小鼠血脂水平的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2002，18(5):599 －600.

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