楊大偉，鐘菊英

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

碎米薺是一種具有多種藥用功能的十字花科植物[1]，碎米薺多糖也擁有多種生理功能[2].在碎米薺多糖分離純化過(guò)程中，乙醇沉淀多糖時(shí)，一種未知有機(jī)物與多糖一起被沉淀(共沉淀物)，這種共沉淀物必須與結(jié)合的多糖有效分離，才能最大程度地將碎米薺多糖提取出來(lái)，增加多糖的得率.

1 材料與方法

1.1 材料

1)試驗(yàn)材料：碎米薺粗多糖溶液(實(shí)驗(yàn)室制取).

2)主要試劑與藥品：甲醇，苯酚，濃硫酸，丙酮，磷酸氫二鈉，以上試劑均為分析純.

3)主要儀器與設(shè)備：瓊脂糖(sepharose) 6B凝膠層析柱，大孔樹(shù)脂(AB-8)吸附層析柱，高效液相色譜儀(D10NEX 美國(guó))，泵：P680 HPLC pump 四元梯度泵，柱溫箱：TCC-100，檢測(cè)器：二極管陳列檢測(cè)器PDA-100，冷凍離心機(jī)，723紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì).

圖1 共沉淀物洗脫曲線

圖2 共沉淀物的瓊脂糖Sepharose 6B凝膠層析

1.2 方法

1.2.1 碎米薺粗多糖與共沉淀物的分離方法 乙醇沉淀的碎米薺粗多糖經(jīng)蒸餾水溶解后，向溶液中加入磷酸氫二鈉等無(wú)機(jī)鹽將結(jié)合在多糖上的共沉淀物絮凝沉淀，離心后，收集沉淀，上清液加入磷酸氫二鈉絮凝共沉淀物，反復(fù)上述操作到上清液加入磷酸氫二鈉無(wú)絮凝現(xiàn)象，保留上清液供后續(xù)多糖純化使用，合并沉淀，將沉淀用適量的蒸餾水溶解.向溶液中加入丙酮，由于共沉淀物是依靠氫鍵等弱作用力與多糖結(jié)合的，采用丙酮等有機(jī)溶劑可將氫鍵等弱作用力破壞，從而實(shí)現(xiàn)多糖與共沉淀物的分離.丙酮沉淀的多糖與共沉淀物再用蒸餾水溶解，溶液又用磷酸氫二鈉絮凝沉淀，離心后，收集上清液，沉淀經(jīng)蒸餾水溶解，如此反復(fù)將沉淀溶解、丙酮沉淀、磷酸氫二鈉絮凝，直到共沉淀物經(jīng)硫酸-苯酚法檢測(cè)呈陰性為止，分別收集上清溶液和共沉淀物，共沉淀物進(jìn)一步純化，上清液供后續(xù)多糖純化使用.

1.2.2 共沉淀物的純化方法 ①將一定濃度的樣品40 mL上大孔樹(shù)脂柱，以流速1.2 mL/min進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，再用濃度梯度30%～80%的甲醇以流速2.5 mL/min通過(guò)樹(shù)脂床進(jìn)行洗脫，層析儀自動(dòng)繪制洗脫曲線[3].洗脫液備用供進(jìn)一步用瓊脂糖sepharose 6B凝膠層析對(duì)共沉淀物進(jìn)行純化;②用瓊脂糖sepharose 6B凝膠層析對(duì)共沉淀物進(jìn)行純化，方法是：以濕法在攪拌下將瓊脂糖sepharose 6B凝膠加入到玻璃層析柱(20×400 mm)中，等凝膠沉降后再將水放出，用蒸餾水充分洗滌層析柱，備用.小心地將真空濃縮并透析后的共沉淀物樣品(3 mL)滴加到層析柱中，讓樣品液過(guò)柱恰好與凝膠介質(zhì)頂端平齊，再用適量的蒸餾水洗滌，讓洗滌液過(guò)柱恰好與凝膠介質(zhì)頂端平齊，最后用蒸餾水洗脫，控制洗脫流速為1.5 mL/min，層析儀自動(dòng)繪制洗脫曲線.

1.2.3 共沉淀物的純度鑒定方法 ①在紫外區(qū)對(duì)共沉淀物溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，確定其特征吸收波長(zhǎng);②高效液相色譜法鑒定共沉淀物純度，采用人工進(jìn)樣，雙蒸餾水洗脫，柱溫30℃，流速1.0 mL/min.

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹(shù)脂分離共沉淀物的結(jié)果

以洗脫時(shí)間為橫坐標(biāo)，洗脫液中共沉淀物的光密度為縱坐標(biāo)，層析儀自動(dòng)繪制洗脫曲線，如圖1所示.用濃度30%～80%的甲醇梯度洗脫時(shí)，得到一個(gè)共沉淀物組分.

2.2 共沉淀物的瓊脂糖(Sepharose) 6B凝膠層析結(jié)果

用瓊脂糖(Sepharose) 6B對(duì)被大孔樹(shù)脂純化的共沉淀物進(jìn)行凝膠層析，結(jié)果如圖2所示.

從圖2的層析結(jié)果可以看出，根據(jù)分子量的大小，碎米薺共沉淀物包括兩個(gè)組分，由于Sepharose 6B分離物質(zhì)的分子量范圍在104～4×106之間[4]，而且這兩個(gè)組分的洗脫時(shí)間也較快，所以上述兩個(gè)共沉淀物組分的分子量在104～4×106之間；第一個(gè)共沉淀物組分的洗脫量較低，后續(xù)的進(jìn)一步純化，尤其是制備工作的難度較大，故沒(méi)有做進(jìn)一步分析，而是選擇第二個(gè)共沉淀物組分做進(jìn)一步的純度鑒定.

2.3 碎米薺共沉淀物的純度鑒定結(jié)果

1)共沉淀物檢測(cè)波長(zhǎng)的掃描結(jié)果 用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)共沉淀物溶液進(jìn)行掃描，掃描結(jié)果如圖3所示.

圖3 共沉淀物樣品的波長(zhǎng)掃描

圖4 共沉淀物在280 nm處的高效液相色譜

從圖3可見(jiàn)，共沉淀物最大吸收波長(zhǎng)在紫外區(qū)，可以進(jìn)一步高效液相色譜法鑒定碎米薺共沉淀物的純度.

2)高效液相色譜法鑒定碎米薺共沉淀物的純度時(shí)，選擇波長(zhǎng)280 nm進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖4所示.

高效液相色譜法鑒定結(jié)果表明，共沉淀物的純度達(dá)到色譜純.

3 討論與小結(jié)

3.1 大孔樹(shù)脂對(duì)共沉淀物的吸附特性

大孔樹(shù)脂吸附層析是基于大孔吸附樹(shù)脂對(duì)欲分離物質(zhì)的吸附作用和分子篩作用進(jìn)行分離純化的[5].從共沉淀物的質(zhì)譜碎片分子結(jié)構(gòu)可知，共沉淀物具有酮基和羧酸酯等極性基團(tuán)，因而大孔樹(shù)脂對(duì)共沉淀物表現(xiàn)出吸附性.

3.2 共沉淀物的濃度不同其大孔樹(shù)脂柱層析條件會(huì)有所變化

雖然本文對(duì)大孔樹(shù)脂分離共沉淀物的層析行為特征和條件進(jìn)行了探討，但實(shí)際研究中共沉淀物的濃度不同，大孔樹(shù)脂的柱層析行為會(huì)有所變化，尤其是其層析條件會(huì)發(fā)生較大的變化，所以本文的大孔樹(shù)脂柱層析條件是在特定的共沉淀物濃度下得到的.盡管如此，本文的研究結(jié)果對(duì)大孔樹(shù)脂柱分離純化共沉淀物仍有一定的參考作用.

綜上所述，以碎米薺粗多糖液為試驗(yàn)材料，用磷酸氫二鈉和丙酮反復(fù)處理共沉淀物把共沉淀物與多糖分離；然后用大孔樹(shù)脂吸附層析對(duì)共沉淀物進(jìn)行純化，層析條件是：一定濃度的樣品40 mL上柱，以流速1.2 mL/min進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，再用濃度30%～80%的甲醇以流速2.5 mL/min通過(guò)樹(shù)脂床進(jìn)行梯度洗脫；最后用瓊脂糖Sepharose 6B(20×400 mm)凝膠過(guò)濾層析將共沉淀物分離為兩個(gè)組分，層析條件是：上樣量3 mL，蒸餾水洗脫，控制洗脫流速為1.5 mL/min.純化的共沉淀物純度為高效液相色譜純.

參考文獻(xiàn):

[1]劉合剛，費(fèi)新貴，陳林.華中碎米薺的生物藥學(xué)研究[J].時(shí)珍國(guó)藥研究,1993,5(3):14-15.

[2]Vliegehthart J F G.Abstract of the 12th International Carbohydrate Symposium[J]. Netherlands:Vonk Publishers,2002:566.

[3]高榮海,李長(zhǎng)彪,劉長(zhǎng)江,等.大孔吸附樹(shù)脂對(duì)大豆異黃酮吸附性能的研究[J].食品工業(yè)科技, 2006,27(10):49-51.

[4]趙永芳.生物化學(xué)技術(shù)原理及其應(yīng)用[M].武漢：武漢大學(xué)出版社，1995:120-121.

[5]汪茂田,謝培山,王忠東,等.天然有機(jī)化合物提取分離榆結(jié)構(gòu)鑒定[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2004:100-101.